生產(chǎn)l-氨基酸的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】生產(chǎn)L-氨基酸的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年10月11日向韓國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?10-2013-0121090以及于2014年7月18日向韓國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?10-2014-0091307的權(quán)益,以引用的方式將其公開(kāi)的內(nèi)容整體納入到本文之中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)【具體實(shí)施方式】涉及利用基因轉(zhuǎn)錄抑制法來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸的 方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 相關(guān)技術(shù)的描述
[0006] 丙酮酸,其是在棒桿菌(coryneform)微生物中對(duì)各種碳源進(jìn)行糖酵解而產(chǎn)生的, 經(jīng)由草酰乙酸而轉(zhuǎn)變成天冬氨酸。天冬氨酸可通過(guò)不同的生物合成通路轉(zhuǎn)變成多種氨基 酸,如蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸以及賴(lài)氨酸等(圖1)。因此,可抑制處于氨基酸生物合成 過(guò)程中各個(gè)分支點(diǎn)上的基因的表達(dá),來(lái)降低副產(chǎn)物生成并提高目的氨基酸生產(chǎn)。
[0007] 如上所述,為了利用基因工程和代謝工程開(kāi)發(fā)能夠高效生產(chǎn)目的材料的微生物菌 株,需要選擇性地控制與微生物各種代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)。最近,報(bào)道了一種用于 減弱基因表達(dá)的技術(shù),稱(chēng)之為"人工會(huì)聚轉(zhuǎn)錄"(artificial convergent transcription) (Krylov 等,J Mol Microbiol Biotechnol,18 :1_13, 2010)。人工會(huì)聚轉(zhuǎn)錄是一種用于減 弱目的基因表達(dá)的技術(shù),通過(guò)將啟動(dòng)子插入到目的基因的轉(zhuǎn)錄終止子的下游區(qū)域中,使得 啟動(dòng)子的相對(duì)方向(opposite direction)引起轉(zhuǎn)錄過(guò)程中源自每個(gè)啟動(dòng)子的RNA聚合酶 復(fù)合體的碰撞。
[0008] 本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種在乙酸鹽存在的情況下選擇性抑制目的基因表達(dá)的技術(shù),通 過(guò)在目的基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)的方向上插入乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行,并有效地應(yīng)用該技術(shù)來(lái)抑 制棒桿菌微生物中位于分支點(diǎn)的基因的表達(dá)。隨后發(fā)明人證實(shí)通過(guò)利用該技術(shù)提供了以高 產(chǎn)量(yield)生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌微生物并完成了本發(fā)明。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)利用乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子抑制目的基因轉(zhuǎn)錄來(lái) 生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】提供了生產(chǎn)L-氨基酸的方法,該方法包括:
[0012] 1)培養(yǎng)能夠生產(chǎn)L-氨基酸的重組棒桿菌微生物,其中該重組棒桿菌微生物通過(guò) 將乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入到染色體中目的基因的終止密碼子的下游轉(zhuǎn)化的;以及
[0013] 2)在培養(yǎng)過(guò)程中加入乙酸鹽以減弱目的基因的表達(dá)并增強(qiáng)重組棒桿菌微生物的 L-氨基酸生產(chǎn)能力。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述
[0015] 根據(jù)結(jié)合附圖進(jìn)行的實(shí)施方式的以下描述,這些和/或其它方面將變得顯而易見(jiàn) 的以及更容易理解,其中:
[0016] 圖1顯示了棒桿菌微生物中的氨基酸生物合成過(guò)程的分支點(diǎn);以及
[0017] 圖2為示意圖,顯示了通過(guò)將aceA基因啟動(dòng)子a)插入到aceE基因的終止密碼子 和轉(zhuǎn)錄終止子上游之間或b)以與aceE基因轉(zhuǎn)錄方向相反的方向插入至轉(zhuǎn)錄終止子下游而 使得aceE基因表達(dá)受抑制。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 現(xiàn)在詳細(xì)參考實(shí)施方式,其實(shí)例在附圖中例示,其中相同的參考編號(hào)在全文中代 表相同的要素。在這個(gè)方面,本發(fā)明【具體實(shí)施方式】可具有不同的形式,并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為 限于本文所述的說(shuō)明書(shū)。因此,下文中僅參照附圖描述【具體實(shí)施方式】以解釋本發(fā)明的方面。 "至少一個(gè)/種"等表述,當(dāng)在一系列要素之前時(shí),修飾了整個(gè)系列的要素,而并不是修飾該 系列的單個(gè)要素。
[0020] 在下文中,詳細(xì)描述了本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】提供了生產(chǎn)L-氨基酸的方法,該方法包括:
[0022] 1)培養(yǎng)能夠生產(chǎn)L-氨基酸的重組棒桿菌微生物,其中該重組棒桿菌微生物是通 過(guò)將乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入到染色體中的目的基因終止密碼子的下游而被轉(zhuǎn)化的;以及
[0023] 2)在培養(yǎng)過(guò)程中加入乙酸鹽以減弱目的基因的表達(dá)并增強(qiáng)重組棒桿菌微生物的 L-氨基酸生產(chǎn)能力。
[0024] 本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"是指在乙酸鹽存在的情況下具有基 因表達(dá)誘導(dǎo)活性的啟動(dòng)子。
[0025] 在棒桿菌微生物中,乙酸鹽被乙酸激酶(acetate kinase) (ackA,NCgl2656)和磷 酸轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphotransacetylase) (pta,NCgl2657),或者被瑭泊酰-CoA :乙酸 CoA-轉(zhuǎn) 移酶(actA,NCgl2480)轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A,隨后在乙醛酸(glyoxalate)循環(huán)中被異梓 樣酸裂合酶(isocitrate lyase) (aceA,Ncgl2248)所代謝。在大腸桿菌(Escherichia coli)中,乙酸鹽被乙酰輔酶A合成酶(acs,b4069)轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A(Gerstmeir等,J Biotechnol,104 :99-122, 2003)。參與乙酸鹽代謝的所述基因的表達(dá)在乙酸鹽存在的情況 下被誘導(dǎo)。因此,當(dāng)使用所述基因的啟動(dòng)子時(shí),可在乙酸鹽存在的情況下特異性地誘導(dǎo)基因 的表達(dá)。
[0026] 乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括異梓檬酸裂合酶(aceA,Ncgl2248)編碼基因的啟動(dòng)子 或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta,NCgl2657)編碼基因和乙酸激酶(ackA,NCgl2656)編碼基因的操 縱子的啟動(dòng)子,其是Pta基因的上游啟動(dòng)子。更具體地,在上述的乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中, aceA基因的啟動(dòng)子如SEQ ID NO: 1的核苷酸序列所示,包括aceA基因上游的486個(gè)堿基 對(duì)以及來(lái)自于開(kāi)放閱讀框(ORF)N端的36個(gè)堿基對(duì)。
[0027] pta基因的上游啟動(dòng)子,其為另一種乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,如SEQ ID NO :2的核苷 酸序列所示,包括Pta基因上游的340個(gè)堿基對(duì)。
[0028] 此外,很明顯,能夠通過(guò)乙酸鹽誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子都可包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。例如,乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可包括:包括SEQ ID NO :1或2核苷酸序列,或包 括SEQ IDNO :1或2核苷酸序列的保守序列并在一個(gè)或多個(gè)位置上進(jìn)行替換、缺失、插入、添 加或倒置(inverse)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸(具體地為2至20,更具體地,2至10,更為具體 地,2至5個(gè)核苷酸,取決于蛋白質(zhì)氨基酸殘基的空間構(gòu)象)的核苷酸序列。只要誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子的功能得到維持或增強(qiáng),可包括核苷酸序列與SEQ ID NO :1或2的核苷酸序列具有超 過(guò)80 %同源性,具體地超過(guò)90 %,更具體地超過(guò)95 %,更更具體地超過(guò)97 %。只要誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子的功能得到維持,替換、缺失、插入、添加或倒置的核苷酸序列可包括自發(fā)的突變體 序列,或者甚至是人工突變體序列。
[0029] 本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"同源性"是指兩條不同核苷酸序列之間的同一性。同源性 可由本領(lǐng)域已知的方法利用計(jì)算參數(shù),諸如得分、同一性和相似性的BLAST 2. 0軟件程序 進(jìn)行測(cè)定。然而,測(cè)定同源性的方法并不限于此。
[0030] 除非在本文中另有說(shuō)明,術(shù)語(yǔ)"上游"是指5'方向,術(shù)語(yǔ)"下游"是指3'方向。通 常,轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的方向是5'至3',因此啟動(dòng)子的位置往往位于目的基因的上游(5')。
[0031] 在本文中,染色體中的目的基因可以是參與從各種碳源中生物合成氨基酸,例如 蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸以及賴(lài)氨酸等的過(guò)程的基因,特別是位于生物合成通路的分支 點(diǎn)上的基因。
[0032] 例如,對(duì)于賴(lài)氨酸,參與丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化的丙酮酸脫氫酶亞基 El (pyruvate dehydrogenase subunit El) (aceE,NCgl2167)基因,從天冬氨酸產(chǎn)生高絲氨 酸的高絲氨酸脫氫酶(homoserine dehydrogenase) (hom,NCglll36)基因,以及利用內(nèi)消 旋-2,6-