25°C至約40°C。可持續(xù)進行培養(yǎng)直到產(chǎn)生所需量的L-氨基酸，但合適的培養(yǎng)時 間可從約10至160小時。
[0055] 關(guān)于本發(fā)明所提供的方法，培養(yǎng)可以以連續(xù)方式或分批方式（例如分批法、分批 補料法以及重復分批補料法）進行。這些培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域是已知的，并可使用任意的培 養(yǎng)方法。
[0056] 本文中所使用的術(shù)語"培養(yǎng)"包括制備培養(yǎng)基和培養(yǎng)微生物的時間兩者。
[0057] 關(guān)于本發(fā)明中提供的方法，該方法可進一步包括純化和回收步驟。根據(jù)諸如分批 培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和分批補料法培養(yǎng)等方法而定，可通過使用本領(lǐng)域已知的合適方法來從培 養(yǎng)溶液中純化或回收目的L-氨基酸。
[0058] 在本發(fā)明的培養(yǎng)中所產(chǎn)生的L-氨基酸可以是選自如下組中的一種：蘇氨酸、甲硫 氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸和丙氨酸，具體而言，賴氨酸或蘇氨酸。
[0059] 在下文中，將參照實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。這些實施例僅用于描述目的 而不是將本發(fā)明的范圍限制于此。 實施例
[0060] 實施例1 :乙酸鹽誘導型啟動子的選擇
[0061] 異檸檬酸裂合酶（aceA，NCgl2248)是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵性酶，異檸檬酸裂合酶 編碼基因在乙酸鹽存在的情況下表達。此外，乙酸激酶（ackA，NCgl2656)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰 酶（pta，NCgl2657)(它們是參與乙酸鹽代謝過程的酶）形成操縱子，并且它們的表達在 乙酸鹽存在的情況下得到增強。aceA基因和pta-ackA操縱子的啟動子區(qū)域是已知的 (Gerstmeir 等，J Biotechnol，104,99-122, 2003)〇
[0062] 在實施例1中，選擇了 aceA基因的啟動子以及pta-ack操縱子的啟動子（其為pta 基因的上游啟動子區(qū)域）以在乙酸鹽存在的情況下抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄?；谠诿绹鳱IH GenBank中登記的aceA基因（NCBI登記號：NCgl2248)，獲得了核苷酸序列（SEQ ID N0:1)， 其包括aceA基因上游的486個堿基對和從開放閱讀框（ORF)N末端起的36個堿基對。此 夕卜，基于在美國NIH GenBank中登記的pta基因（NCBI登記號：NCgl2657)，獲得了包括pta 基因上游340個堿基對的核苷酸序列（SEQ ID NO :2)。
[0063] 實施例2 :用于抑制aceE基因表達的載體的制備
[0064] 丙酮酸脫氫酶亞基El(aceE，NCgl2167)是丙酮酸脫氫酶復合體（PDHC)的蛋白質(zhì) 亞基之一，其參與丙酮酸（其為糖酵解最終的代謝產(chǎn)物）流入TCA循環(huán)。因此，使aceE基 因表達的減弱可降低碳源向TCA循環(huán)的流入并提高碳源流入賴氨酸生物合成通路，從而提 高賴氨酸生產(chǎn)（Blombach 等，Appl Microbiol Biotechnol，76(3) :615_23, 2007) 〇
[0065] 將aceA基因啟動子插入到aceE基因的下游，以使得在乙酸鹽存在的情況下，從此 啟動子開始的轉(zhuǎn)錄與aceE基因轉(zhuǎn)錄的初始方向相對，從而可選擇地抑制aceE基因的表達 (圖 2)。
[0066] 首先，使用CLC主工作臺軟件（CLC Bio，丹麥）來預測aceE基因的轉(zhuǎn)錄終止子。 轉(zhuǎn)錄終止子是富含GC堿基的反向重復序列，其形成發(fā)夾環(huán)以終止基因轉(zhuǎn)錄。對aceE基因 轉(zhuǎn)錄終止子預測的結(jié)果顯示，從aceE基因終止密碼子起其下游的第21個堿基對至第56個 堿基對之間的36個堿基對形成了發(fā)夾環(huán)，其為轉(zhuǎn)錄終止子?；诖私Y(jié)果，制備了兩個載體， 以將aceE啟動子分別插入至aceE基因轉(zhuǎn)錄終止子的上游或下游，使得從此啟動子的轉(zhuǎn)錄 可以在與初始轉(zhuǎn)錄的方向相對的方向發(fā)生。
[0067] 〈2_1>用于抑制aceE基閔表汰的pDZ-aceEl-PaceA裁體的制各
[0068] 通過將aceA基因啟動子插入到aceE基因終止密碼子的下游（在終止密碼子和轉(zhuǎn) 錄終止子的上游之間）來制備載體。
[0069] 為了獲得谷氨酸棒桿菌來源的aceE基因的片段，使用谷氨酸棒桿菌KCCM11016P 的染色體DNA作為模板來合成引物（SEQ ID NO :3和4)，所述引物被設計為在片段的5'端 具有XbaI限制性酶識別位點以及在片段的3'端具有SpeI限制性酶識別位點。利用合成 的引物進行PCR以獲得包括從aceE基因的起始密碼子起第2474個核苷酸至第2769個核 苷酸（aceE基因的終止密碼子）之間共296個堿基對的DNA片段。此外，合成了設計為在 片段的5'端具有SpeI限制性酶識別位點以及在片段的3'端具有XbaI限制性酶識別位點 的引物（SEQ ID NO :5和6)，并使用該引物進行PCR以獲得包括位于aceE基因終止密碼子 下游的300個堿基對的DNA片段。使用PfuUltra?高保真DNA聚合酶（Stratagene)作為 聚合酶進行PCR，其使用30個循環(huán)的95 °C變性30秒，55 °C退火30秒，以及72 °C聚合30秒； 然后在72 °C聚合7分鐘。
[0070] 使用In-fusion克隆試劑盒（TAKARA，日本）將這兩個PCR擴增產(chǎn)物與已用XbaI 限制性酶切割準備好的用于進行染色體導入的PDZ載體（參見韓國專利：10-0924065)進 行克隆以制備pDZ-aceEl載體。
[0071] SEQ ID NO :3 :aceE_PlF 5' -ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc-3'
[0072] SEQ ID NO :4 :aceE_PlR 5' -ttgagactagttattcctcaggagcgtttg-3'
[0073] SEQ ID NO :5 :aceE_P2F 5' -gaataactagtctcaagggacagataaatc-3'
[0074] SEQ ID NO :6 :aceE_P2R 5' -gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag-3'
[0075] 為了獲得谷氨酸棒桿菌來源的aceA基因的啟動子片段，合成了設計為在片段的 5'端和3'端具有SpeI限制性酶識別位點的引物（SEQ ID NO :7和8)。使用谷氨酸棒桿菌 KCCM11016P的染色體DNA作為模板以及合成的引物來進行PCR以擴增約500堿基對的如 SEQ ID NO :1所示的啟動子區(qū)域。利用In-fusion克隆試劑盒（TAKARA，日本）將PCR擴增產(chǎn) 物與用SpeI限制性酶處理pDZ-aceEl而獲得的DNA片段進行克隆以制備pDZ-aceEl-PaceA 載體。
[0076] SEQ ID NO :7 :PaceA_P3F 5' -gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg-3'
[0077] SEQ ID NO :8 :PaceA_P3R 5' -ctgaggaata actagtttcctgtgcggtacgtggc-3'
[0078] 〈2-2>用于抑制aceE基閔表汰的PDZ-aceE2-PaceA裁體的制各
[0079] 通過將aceA基因啟動子插入至aceE基因轉(zhuǎn)錄終止子的下游來制備載體。
[0080] 為了獲得谷氨酸棒桿菌來源的aceE基因的片段，使用谷氨酸棒桿菌KCCM11016P 的染色體DNA作為模板，并使用設計為在片段的5'端具有XbaI限制性酶識別位點以及在 片段的3'端具有SpeI限制性酶識別位點的引物（SEQ ID NO :9和10)。利用合成的引物進 行PCR以獲得包括從aceE基因起始密碼子起第2538個核苷酸至終止密碼子下游第62個核 苷酸之間共294個堿基對的DNA片段。此外，使用設計為在片段的5'端具有SpeI限制性 酶識別位點以及在片段的3'端具有XbaI限制性酶識別位點的引物（SEQ ID NO : 11和12) 進行PCR，以獲得包括aceE基因終止密碼子下游第69個核苷酸至第362個核苷酸之間的 294個堿基對的DNA片段。使用PfuUltra?高保