真DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶， 進(jìn)行PCR :30個(gè)循環(huán)的95°C變性30秒，55°C退火30秒，以及72°C聚合30秒；然后在72°C 聚合7分鐘。
[0081] 使用In-fusion克隆試劑盒（TAKARA，日本）將這兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與已用XbaI 限制性酶切割而準(zhǔn)備好的用于進(jìn)行染色體導(dǎo)入的PDZ載體進(jìn)行克隆以制備pDZ-aceE2載 體。
[0082] SEQ ID NO :9 :aceE_P4F 5' -ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc-3'
[0083] SEQ ID NO :10 :aceE_P4R 5' -gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta-3'
[0084] SEQ ID NO :11 :aceE_P5F 5' -gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc-3'
[0085] SEQ ID NO :12 :aceE_P5R 5' -gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac-3'
[0086] 為了獲得谷氨酸棒桿菌來(lái)源的aceA基因的啟動(dòng)子片段，合成了設(shè)計(jì)為在片段的 5'端和3'端具有SpeI限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的引物（SEQ ID NO :13和14)。使用谷氨酸棒 桿菌KCCM11016P的染色體DNA作為模板以及合成的引物來(lái)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增約500堿基 對(duì)的如SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子區(qū)域。利用In-fusion克隆試劑盒（TAKARA，日本）將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與用SpeI限制性酶處理pDZ-aceE2載體而獲得的DNA片段進(jìn)行克隆以制備 pDZ_aceE2_PaceA 載體。
[0087] SEQ ID NO :13 :PaceA_P6F 5' -aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg-3'
[0088] SEQ ID NO :14 :PaceA_P6R 5' -gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc-3'
[0089] 實(shí)施例3 :aceA基因啟動(dòng)子插入aceE基因下游的囷株的制備
[0090] 通過(guò)電脈沖將實(shí)施例2中制備的pDZ-aceEl-PaceA和pDZ-aceE2_PaceA載體分別 導(dǎo)入到L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株-谷氨酸棒桿菌KCCMl 1016P中（轉(zhuǎn)化方法描述于Van der Rest 等，Appl Microbiol Biotechnol，52 :541_545，1999 中）。通過(guò)實(shí)施 PCR 來(lái)選擇相應(yīng)的菌 株以獲得L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株，在所述菌株中，aceA基因啟動(dòng)子插入到染色體上的aceE基 因終止密碼子下游以使得從此啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可以在與初始轉(zhuǎn)錄的方向相反的方向發(fā)生。所 選擇出來(lái)的菌株分別命名為谷氨酸棒桿菌KCCM11016P : :aCeEl-PaCeA以及谷氨酸棒桿菌 KCCM11016P: :aceE2-PaceA。谷氨酸棒桿菌 KCCM11016P: :aceEl-PaceA 于 2013 年 6 月 12日以谷氨酸棒桿菌CA01-2271為名國(guó)際保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心（Korean Culture Center of Microorganism(KCCM))，登錄號(hào)為 KCCM11432P。利用 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID N0:6作為引物對(duì)KCCM11016P::aceEl-PaceA，利用SEQIDN0 :9和SEQIDN0:12作為引 物對(duì)KCCM11016P : :aceE2-PaceA進(jìn)行PCR來(lái)分析所獲得的目的區(qū)域的核苷酸序列，以此來(lái) 核實(shí)所制備的菌株。
[0091] 實(shí)施例4 :aceA基因啟動(dòng)子插入aceE基因下游的菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)力比較
[0092] 利用下文所述的方法培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌KCCM11016P菌株（用作親本菌株）以及 谷氛酸棒桿菌 KCCM11016P : :aceEl_PaceA 和谷氛酸棒桿菌 KCCM11016P : :aceE2_PaceA (為 實(shí)施例3中所制備的L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌株）。
[0093] 將谷氨酸棒桿菌KCCM11016P KCCM11016P : :aceEl-PaceA以及谷氨酸棒桿菌 KCCM11016P : :aceE2-PaceA分別接種至其中含有25ml種子培養(yǎng)基的250ml有轉(zhuǎn)角擋板的 (corner-baffled)燒瓶中，隨后在30°C以200rpm振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。將Iml種子培養(yǎng)溶液加 入至含有下文所述24ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml有轉(zhuǎn)角擋板的燒瓶中，隨后在30°C以200rpm 振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。相應(yīng)的種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成如下所述。
[0094] 〈種子培養(yǎng)基（ρΗ7· 0) >
[0095]葡萄糖 20g，蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，尿素 I. 5g，KH2P044g，K2HP048g， MgSO4 ·7 (H2O) 0· 5g，生物素 100 μ g，鹽酸硫胺 1000 μ g，泛酸鈣 2000 μ g，煙酰胺 2000 μ g (以 IL蒸餾水為參準(zhǔn)）。
[0096] 〈生產(chǎn)培養(yǎng)基（ρΗ7· 0) >
[0097] 葡萄糖 l〇〇g，（NH4)2S0440g，大豆蛋白 2. 5g，玉米衆(zhòng)固體 5g，尿素 3g，KH2PO4Ig, MgSO4 · 7 (H2O) 0· 5g，生物素 100 μ g，鹽酸硫胺 1000 μ g，泛酸鈣 2000 μ g，煙酰胺 3000 μ g， CaC0330g (以IL蒸餾水為參準(zhǔn)）。
[0098] 在培養(yǎng)之后，用HPLC來(lái)測(cè)量L-賴(lài)氨酸的濃度。當(dāng)未加入乙酸鹽的時(shí)候，谷氨酸棒 桿菌 KCCMl 1016P、KCCMl 1016P : :aceEl-PaceA 和 KCCMl 1016P : :aceE2-PaceA 培養(yǎng)溶液中 的L-賴(lài)氨酸濃度顯示在表1中。
[0099] 表I. L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)的變化（未加入乙酸鹽）
[0100]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括： 1) 培養(yǎng)能夠生產(chǎn)L-氨基酸的重組棒桿菌微生物，其中該重組棒桿菌微生物是通過(guò)將 乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子插入到染色體中目的基因的終止密碼子的下游轉(zhuǎn)化的；以及 2) 在培養(yǎng)過(guò)程中加入乙酸鹽以減弱所述目的基因的表達(dá)，并且以增強(qiáng)所述重組棒桿菌 微生物的L-氨基酸生產(chǎn)能力。
2. 如權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中所述終止密碼子的下游介于所述目的基 因的所述終止密碼子與轉(zhuǎn)錄終止子的上游之間。
3. 如權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中所述乙酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO :2的核苷酸序列所示。
4. 如權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中所述目的基因是選自如下組中的至少 一種基因：編碼丙酮酸脫氫酶亞基El (NCgl2167)的基因，編碼高絲氨酸脫氫酶（NCgl 1136) 的基因，編碼Μ)Ρ-Ν-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸連接酶（NCgl2083) 基因以及編碼二氫卩比啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinate synthase) (NCgll896)的基因。
5. 如權(quán)利要求4的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸或L-蘇氨 酸。
【專(zhuān)利摘要】提供了使用重組棒桿菌微生物來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸的方法，在該重組棒桿菌微生物中利用基因轉(zhuǎn)錄抑制方法減弱了目的基因的表達(dá)。KCCM11432P20130612
【IPC分類(lèi)】C12P13-08, C12R1-15
【公開(kāi)號(hào)】CN104561163
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410654216
【發(fā)明人】文準(zhǔn)玉, 林相曹, 權(quán)刀顯, 李光鎬, 裵賢原
【申請(qǐng)人】Cj第一制糖株式會(huì)社
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年10月11日