評估用于施用的轉(zhuǎn)導t細胞的適用性的方法
【專利說明】評估用于施用的轉(zhuǎn)導T細胞的適用性的方法
[0001] 關于聯(lián)邦資助的研宄或開發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研宄院（NIH)給予的資助號K24CA11787901、 1PN2-EY016586、1R01CA105216、1R01CA120409、R01AI057838 和 R01113482 下利用政府支持 完成。政府擁有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
[0003] 相關申請的交叉引用
[0004] 本申請要求2012年7月13日提交的美國臨時申請?zhí)?1/671，495的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi) 容在此通過引用以其全部并入本文。
【背景技術】
[0005] 大部分具有B-細胞惡性腫瘤一一包括慢性淋巴細胞白血?。–LL)的患者，將死于 他們的疾病。治療這些患者的一個方法是基因修飾T細胞以通過嵌合抗原受體（CAR)的 表達靶向在腫瘤細胞上表達的抗原。CAR為設計來以人白細胞抗原-非依賴性的方式識別 細胞表面抗原的抗原受體。利用表達CAR的基因修飾細胞治療這些類型患者的嘗試已經(jīng) 得到非常有限的成功。見例如，Brentjens 等，2010，Molecular Therapy, 18:4,666-668; Morgan 等，2010，Molecular Therapy, 2010 年 2月 23 日在線公布，1-9 頁；和 Till 等，2008, Blood, 112:2261-2271。
[0006] 盡管CAR可以以類似于內(nèi)源T-細胞受體的方式引發(fā)T-細胞活化，但至今該技術 的臨床應用的主要阻礙已經(jīng)限于CAR+T細胞的體內(nèi)擴展、注入后細胞的快速消失和令人失 望的臨床活性（Jena 等，Blood, 2010, 116:1035-1044 ;Uckun 等，Blood, 1988,71:13-29)。 產(chǎn)生用于施用給人的基因修飾的T細胞的方法具有產(chǎn)生不需要的污染物的可能性，所述污 染物可在施用后對基因修飾的T細胞的持續(xù)和功能造成負面影響。
[0007] 因此，在本領域中需要通過檢測可以對基因修飾細胞的持續(xù)和功能造成負面影響 的污染物，分析用于施用給受試人的轉(zhuǎn)導T細胞的適用性。本發(fā)明滿足了該需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了分析基因修飾的T細胞以檢測污染物的方法，其中基因修飾的T細 胞包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸，其中CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺 激信號傳導區(qū)和信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0009] 在一個實施方式中，基因修飾的T細胞通過用慢病毒載體轉(zhuǎn)導被基因修飾。
[0010] 在一個實施方式中，污染物是選自內(nèi)毒素、支原體、具有復制能力的慢病毒（RCL)、 p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘留的抗-⑶3/抗-⑶28包被的珠、小鼠抗體、混合人血清、牛血 清白蛋白、牛血清、培養(yǎng)基組分、載體包裝細胞或質(zhì)粒組分、細菌和真菌中的至少一種。
[0011] 在一個實施方式中，細菌是選自糞產(chǎn)堿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、 腦膜炎雙球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌A群中的至少一 種。
[0012] 在一個實施方式中，信號傳導結(jié)構(gòu)域是CD3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0013] 在一個實施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其抗原-結(jié)合片段。
[0014] 在一個實施方式中，抗原-結(jié)合片段是Fab或scFv。
[0015] 在一個實施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原。
[0016] 在一個實施方式中，腫瘤抗原與血液學惡性腫瘤相關。
[0017] 在一個實施方式中，腫瘤抗原與實體瘤相關。
[0018] 在一個實施方式中，腫瘤抗原選自⑶19、⑶20、⑶22、ROR1、間皮素、⑶33/IL3Ra、 c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、NY-ESO-I TCR、MAGE A3 TCR 和其任何組合。
[0019] 在一個實施方式中，共刺激信號傳導區(qū)包括選自⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、 CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關抗原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與 CD83特異性結(jié)合的配體和其任何組合的共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
[0020] 在一個實施方式中，因為污染物的鑒定和定量，基因修飾的T細胞不被施用給受 試人。
[0021] 在一個實施方式中，因為與相應的對照水平相比污染物的量過多，基因修飾的T 細胞不被施用給受試人。
【附圖說明】
[0022] 當與附圖結(jié)合閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的以下詳細描述。為 了說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方式。然而，應當理解本發(fā)明不限于 附圖中所示的實施方式的精確布置和手段。
[0023] 圖1，包括圖IA至1C，是基因轉(zhuǎn)移載體和轉(zhuǎn)基因、基因修飾的T細胞制造和臨床方 案設計的示意圖的一系列圖像。圖IA描繪了顯示主要功能元件的慢病毒載體和轉(zhuǎn)基因。 產(chǎn)生了指導源于FMC63鼠科單克隆抗體的抗-CD19scFv、人CD8a鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域、和人 4-1BB與CD3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域的表達的水泡性口炎病毒G蛋白假型臨床等級慢病毒載體 (命名為pELPsl9BBZ)。通過包括EF-la(延伸因子-la啟動子）；LTR，長末端重復 ；RRE， rev應答元件（cPPT)和中央終止序列（CTS)，指導轉(zhuǎn)基因的組成型表達。圖不是按比例的。 圖IB描繪了 T細胞制造。自體細胞經(jīng)由單采血液成分術獲得，并且對于非-CLL研宄對象， T細胞通過單核細胞淘洗（elutriation)富集。對于CLL對象，殘余的白血病細胞通過添 加抗-⑶3/⑶28包被的順磁珠用于陽性選擇和T細胞活化而被耗盡。對于非-CLL對象，沖 洗淘洗的細胞，然后通過添加抗-CD3/CD28包被的順磁珠用于T細胞活化。慢病毒載體在 細胞活化時被添加，并在培養(yǎng)開始后第3天被沖洗掉。兩天后，細胞在搖動平臺裝置（WAVE Bioreactor System)上擴展額外的3-7天。在培養(yǎng)的最后一天，通過經(jīng)過磁場珠被移出，并 且CART19T細胞被收獲、沖洗和冷藏在難溶的（infusible)培養(yǎng)基中。圖IC描繪了臨床方 案設計。給予患者如上所述的淋巴耗盡（Iymphodepleting)化療，隨后在15-20分鐘的時 期內(nèi)通過靜脈內(nèi)重力流滴注CART19注入劑#1。在完成化療后1至5天開始，利用在3天內(nèi) 的分次劑量方法（10%、30%、60%)給予注入。在研宄第4周進行終點測定。在主動監(jiān)測 結(jié)束后，按照FDA指南，對象被轉(zhuǎn)移至目標流程，以長期追蹤。
[0024] 圖2描繪了 CART-19細胞的制造方法。
[0025] 圖3是列出了在轉(zhuǎn)導T細胞上執(zhí)行的分析的類型的表格。
[0026] 圖4描繪了在離體培養(yǎng)時期期間，量化VSV-G核酸的分析的結(jié)果。
[0027] 圖5描繪了在離體培養(yǎng)時期期間，量化HIVgag核酸的分析的結(jié)果。
[0028] 發(fā)明【具體實施方式】
[0029] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸的載體的方法，所述載體適 于目的用于施用給受試人的T細胞的轉(zhuǎn)導。本發(fā)明還涉及用包括編碼嵌合抗原受體（CAR) 的核酸的載體轉(zhuǎn)導T細胞的方法，目的用于施用給受試人。在優(yōu)選的實施方式中，載體是慢 病毒載體。本發(fā)明涉及采用慢病毒載體轉(zhuǎn)導以表達CAR的T細胞的過繼細胞轉(zhuǎn)移。CAR是 聯(lián)合對期望的靶抗原（例如腫瘤抗原）的基于抗體的特異性和T細胞受體-活化胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域以產(chǎn)生顯示特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0030] 在一些實施方式中，本發(fā)明的方法涉及分析對轉(zhuǎn)導T細胞目的用于施用給受試人 有用的載體上清液的方法。在其它實施方式中，本發(fā)明的方法涉及分析目的用于施用給受 試人的轉(zhuǎn)導T細胞的方法。在各種實施方式中，本發(fā)明的分析方法包括分析T細胞存活、T細 胞特性（例如 CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD45RA、CD57、CD62L、CD95、CD127、CD134、CD244、 CCR7、CD40L、CTLA4、ro-1、HLA-DR、??Μ3、Ki-67、穿孔蛋白和/或粒酶表達）、轉(zhuǎn)導效率的方 法，以及檢測和量化與制造工藝有關的污染物的方法，所述污染物例如內(nèi)毒素、支原體、具 有復制能力的慢病毒（RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、殘留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、 小鼠抗體、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養(yǎng)基組分、載體包裝細胞或質(zhì)粒組分、細 菌（例如糞產(chǎn)堿菌、白色念珠菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎雙球菌、銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌A群）和真菌。本發(fā)明不限制于任何具體的污 染物。相反地，本發(fā)明包括影響轉(zhuǎn)導T細胞的安全或功效的任何污染物的分析方法。
[0031] 本發(fā)明一般地涉及使用載體以基因修飾T細胞從而穩(wěn)定表達期望的CAR。表達CAR 的T細胞在本文被稱為CAR T細胞或CAR修飾的T細胞。優(yōu)選地，該細胞可被基因修飾以 在其表面上穩(wěn)定表達抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，給予MHC非依賴性的新型抗原特異性。在一些實例 中，T細胞被基因修飾以穩(wěn)定表達CAR，所述CAR將特異性抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3- ζ 鏈或Fcy RI蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合為單一嵌合蛋白。
[0032] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括具有抗原識別結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜 結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關聯(lián)的跨膜 結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，可選擇或由氨基酸置換修飾跨膜結(jié)構(gòu)域，以避免這樣的結(jié)構(gòu) 域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，以最小化與受體復合物的其它成員的相 互作用。優(yōu)選地，跨膜結(jié)構(gòu)域為⑶8 α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。
[0033] 相對于胞漿結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的CAR可被設計為由其本身包括CD28和/或4-1ΒΒ信 號傳導結(jié)構(gòu)域，或與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其它期望的胞漿結(jié)構(gòu)域（一個或 多個）聯(lián)合。在一個實施方式中，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可被設計為進一步包括CD3-G的信號 傳導結(jié)構(gòu)域。例如，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括但不限于⑶3- ζ、4-1ΒΒ和⑶28信號傳導模 塊和其組合。因此，本發(fā)明提供了 CAR T細胞和它們用于過繼療法的方法。
[0034] 本發(fā)明包括生產(chǎn)包括編碼抗-⑶19CAR的核酸的載體的方法，所述抗-⑶19CAR包 括⑶3-ζ和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域二者。在一個實施方式中，載體包括期望的CAR，例如包括 抗-⑶19、⑶8 α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域，以及人4-1BB和⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域的CAR。本發(fā) 明不限于包括抗-⑶19的CAR，而也包括與選自⑶137 (4-1BB)信號傳導結(jié)構(gòu)域、⑶28信號 傳導結(jié)構(gòu)域、CD3G信號結(jié)構(gòu)域和其任何組合的一個或多個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的任何抗原結(jié) 合部分。在優(yōu)選的實施方式中，載體為慢病毒載體。
[0035]
[0036] 除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明涉及領域的技術人 員通常理解的相同的含義。盡管可在測試本發(fā)明的實踐中使用類似于或等同于本文描述的 那些方法和材料的任何方法和材料，但優(yōu)選的材料和方法在本文中進行描述。在描述和要 求保護本發(fā)明時，將使用以下術語。
[0037] 也應理解本文使用的術語僅是為了描述【具體實施方式】的目的，并不意欲是限制性 的。
[0038] 本文使用的冠詞"一個（a) "和"一個（an) "指的是一個或多于一個（即，指的是 至少一個）的該冠詞語法對象。舉例說明，"一個元件"表示一個元件或多于一個的元件。
[0039] 如本文使用的"大約"，當指的是諸如量、時間期間等可測量的值時，表示包括從 給定值的±20%或±10%，在一些實例中±5%，在一些實例中±1%，和在一些實例中 ±0. 1 %的變化，只要這些變化適于實施公開的方法。
[0040] "活化"，如本文所使用的，指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖的T細 胞的狀態(tài)?；罨部膳c誘導的細胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應子功能相關。術語"活化的T 細胞"指的是經(jīng)歷細胞分裂的T細胞等。
[0041] 術語"抗體"，如本文所用的，指的是與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子?？?體可為源于自然源或源于重組源的完整的免疫球蛋白，并可為完整免疫球蛋白的免疫 反應部分。抗體通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存 在，包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab) 2，以及單鏈抗體和人源化抗體 (Harlow 等,1999, In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ；Harlow 等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 等，1988, Science 242:423-426)。
[0042] 術語"抗體片段"指的是完整抗體的一部分，并指的是完整抗體的抗原決定可變 區(qū)。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段，由抗體片段形成的線性 抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
[0043] "抗體重鏈"，如本文所用的，指的是以其自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子中的 兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
[0044] "抗體輕鏈"，如本文所用的，指的是以其自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子中的 兩種類型的多肽鏈中較小的鏈。κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
[0045] 如本文所用的術語"合成抗體"，指利用重組DNA技術產(chǎn)生的抗體，諸如例如，如本 文所述的由噬菌體表達的抗體。該術語也應當被解釋為指已經(jīng)由DNA分子的合成產(chǎn)生的抗 體，所述DNA分子編碼該抗體并且該DNA分子表達抗體蛋白或規(guī)定該抗體的氨基酸序列，其 中DNA或氨基酸序列已經(jīng)利用本領域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技術獲得。
[0046] 如本文所用的術語"抗原"或"Ag"被定義為激發(fā)免疫應答的分子。該免疫應答可 涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細胞的活化，或兩者。技術人員將理解實際上包括所有的 蛋白質(zhì)或肽的任何大分子可用作抗原。此外，抗原可源自重組DNA或基因組DNA。技術人員 將理解任何DNA-一其包括編碼引起免疫應答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列， 因此編碼如本文使用的術語"抗原"。此外，本領域技術人員將理解抗原不必單獨地由基因 的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于多于一個的基因的部分核 苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以不同的組合進行布置以引起期望的免疫應答。而 且，技術人員將理解抗原根本不必由"基因"進行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產(chǎn)生、 合成或可源自生物學樣本。這樣的生物學樣本可包括但不限于組織樣本、腫瘤樣本、細胞或 生物學流體。
[0047] 如本文所用的術語"抗腫瘤效應"，指的是生物學效應，其可由腫瘤體積的減小、月中 瘤細胞數(shù)目的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)目的減少、預期壽命的增加或與癌性病癥相關的各種生理癥狀 的改善清楚表示。"抗腫瘤效應"也可由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤在第 一位置的發(fā)生的能力清楚表示。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，術語"自體抗原"指由免疫系統(tǒng)錯誤識別為外源的任何自身抗原。自 體抗原包括但不限于細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白，其包括細 胞表面受體。
[0049] 如本文所用的術語"自身免疫疾病"被定義為由自身免疫應答產(chǎn)生的紊亂。自身 免疫疾病是對自身抗原的不適當和過度應答的結(jié)果。自身免疫疾病的實例包括但不限于阿 狄森氏疾病、斑禿、強直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病 (I型）、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴 雷綜合征、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常型 天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合征、脊椎關節(jié)病 變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等等。
[0050] 如本文所用的，術語"自體"指關于源自相同個體的任何物質(zhì)，它隨后被再次引入 該個體。
[0051] "同種異基因的（allogeneic) "指的是源自相同物種的不同動物的移植物。
[0052] "異種的（xenogeneic) "指的是源自不同物種的動物的移植物。
[0053] 如本文所用的術語"癌癥"被定義為以畸變細胞的快速和失控生長為特征的疾病。 癌癥細胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其它部分。各種癌癥的實例包括 但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦 癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0054] 如本文使用的術語"共刺激配體"包括特異性結(jié)合T細胞上的關聯(lián)共刺激分子的 抗原呈遞細胞（例如aAPC、樹突細胞、B細胞等等）上的分子，由此除了通過例如將TCR/ CD3復合物與用肽負載的MHC分子結(jié)合提供的初級信號之外，還提供介導T細胞應答的信 號，所述T細胞應答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括但不限于CD7、 B7-1 (CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可誘導的共刺激配體（ICOS-L)、 細胞間粘附分子（ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素 β 受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動劑或抗體和與Β7-Η3特異性結(jié) 合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于T細胞上的共刺激分子特異性結(jié)合的抗 體，例如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關抗 原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和與 CD83 特異性結(jié)合的配體。
[0055] "共刺激分子"指的是與共刺激配體特異性結(jié)合的T細胞上的關聯(lián)結(jié)合伴侶，由此 通過T細胞介導共刺激應答，例如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I類分子、 BTLA和Toll配體受體。
[0056] 如本文所用的，"共刺激信號"指的是與初級信號結(jié)合的信號，例如TCR/CD3連接作 用，導致T細胞增殖和/或關鍵分子的上調(diào)或下調(diào)。
[0057] "疾病"是動物的一種健康狀態(tài)，其中動物不能保持穩(wěn)態(tài)，并且其中如果不改善該 疾病，則動物的健康繼續(xù)惡化。與之相比，動物中的"紊亂"是一種健康狀態(tài)，其中動物能夠 保持穩(wěn)態(tài)，但其中動物的健康狀態(tài)與它沒有處于該紊亂相比不太有利。保持不治療，紊亂不 必定引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。
[0058] 如本文所用的"有效量"，指提供治療性或預防性益處的