聚集體而存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合物。
[0148] 不管用于將外源核酸引入宿主細(xì)胞，或以其它方式將細(xì)胞暴露于本發(fā)明的抑制劑 的方法，為了證實(shí)在宿主細(xì)胞中存在重組DNA序列，可實(shí)施多種測定。這樣的測定包括例如 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的"分子生物學(xué)"測定，例如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR ; "生物化學(xué)"測定，例如，例如通過免疫學(xué)手段（ELISA和蛋白質(zhì)印跡）或通過本文描述的落 入本發(fā)明范圍內(nèi)的鑒定試劑的測定，檢測特定肽的存在或不存在。
[0149] T細(xì)朐的來源
[0150] 在本發(fā)明的T細(xì)胞的擴(kuò)展和基因修飾前，從對象獲得T細(xì)胞的來源。T細(xì)胞可從許 多來源中獲得，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位 的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可使用在本領(lǐng)域中可 用的任何數(shù)量的T細(xì)胞系。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，T細(xì)胞可利用技術(shù)人員已知的任 何數(shù)量的技術(shù)例如Ficoll?分離法自從對象中收集的單位血液中獲得。在一個優(yōu)選實(shí)施方 式中，來自個體循環(huán)血液中的細(xì)胞通過單采血液成分術(shù)獲得。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物通常包 含淋巴細(xì)胞--其包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、其它成核的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血 小板。在一個實(shí)施方式中，可沖洗由單采血液成分術(shù)收集的細(xì)胞以移除血漿部分并將細(xì)胞 放置在適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中，用于隨后的處理步驟。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，用磷 酸鹽緩沖鹽水（PBS)沖洗細(xì)胞。在可選實(shí)施方式中，沖洗液缺少鈣并可缺少鎂，或可缺少很 多一一如果不是全部的話一一的二價陽離子。此外，令人驚訝地，在缺少鈣的情況下的初始 活化步驟導(dǎo)致放大的活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解沖洗步驟可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法完成，例如根據(jù)制造商的使用說明通過使用標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)、半自動"最大限度"離心 機(jī)（例如Cobe 2991細(xì)胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細(xì)胞回收器5)。在沖 洗后，細(xì)胞可重懸浮在多種生物相容的緩沖液中，比如，例如無 Ca2+、無 Mg2+PBS、PlasmaLyte A、5%右旋糖的0. 45%氯化鈉溶液或含有或不含有緩沖液的任何組成的其它鹽溶液。可選 地，可移除單采血液成分術(shù)樣本的不期望組分，并且將細(xì)胞直接重懸浮在培養(yǎng)基中。
[0151] 在另一個實(shí)施方式中，T細(xì)胞通過溶解紅細(xì)胞和耗盡單核細(xì)胞從外周血淋巴細(xì) 胞中分離出來，例如，通過經(jīng)過PERC0LL?梯度的離心或通過逆流離心淘洗或Miltenyi CliniMACS、或磁珠、或結(jié)合至抗體的磁珠。T細(xì)胞的特定亞群，例如⑶3 +、⑶28+、⑶4+、⑶8+、 ⑶45RA+、⑶45R0+、⑶62L+、⑶127+T細(xì)胞，可進(jìn)一步通過陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)行分離或耗 盡。例如，在一個實(shí)施方式中，T細(xì)胞通過與抗-⑶3/抗-⑶28(即，3X28)-綴合珠例如 DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T -起溫育持續(xù)足以陽性選擇期望T細(xì)胞的時間段，進(jìn) 行分離。在一個實(shí)施方式中，時間段為大約30分鐘。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，時間段范圍 為30分鐘至36小時或更長，和其間的所有的整數(shù)值。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，時間段是至 少1、2、3、4、5或6小時。在還另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，時間段為10至24小時。在一個 優(yōu)選實(shí)施方式中，溫育時間段為24小時。對于分離來自具有白血病的患者的T細(xì)胞，使用 更長的溫育時間例如24小時，可增加細(xì)胞產(chǎn)量。更長的溫育時間可用于在與其它細(xì)胞類型 相比具有更少T細(xì)胞的任何情況下分離T細(xì)胞，例如，在分離來自腫瘤組織或來自無免疫應(yīng) 答個體的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL)中。進(jìn)一步，使用更長的溫育時間可增加 CD8+T細(xì)胞的 捕獲效率。因此，通過簡單地縮短或延長時間，允許T細(xì)胞結(jié)合至⑶3/⑶28珠，和/或通過 增加或減少珠與T細(xì)胞的比率（如本文中進(jìn)一步描述的），在培養(yǎng)初始或在該過程的其它時 間點(diǎn)上，可優(yōu)先選擇或排除T細(xì)胞的亞群。此外，通過增加或減少珠或其它表面上抗-CD3 和/或抗-CD28抗體的比率，在培養(yǎng)初始或在其它期望的時間點(diǎn)上，可優(yōu)先選擇或排除T細(xì) 胞的亞群。技術(shù)人員將理解多輪選擇也可用于本發(fā)明的內(nèi)容中。在某些實(shí)施方式中，可期 望實(shí)施選擇程序并在活化和擴(kuò)展過程中使用"未選擇的"細(xì)胞。"未選擇的"細(xì)胞也可經(jīng)歷 更多輪的選擇。
[0152] 通過陰性選擇T細(xì)胞群的富集可利用針對陰性選擇的細(xì)胞獨(dú)特的表面標(biāo)記的抗 體的組合而完成。一種方法為細(xì)胞分選和/或選擇，其經(jīng)由陰性磁性免疫粘附或使用針對 存在于陰性選擇的細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體的混合物的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。例 如，為了通過陰性選擇富集⑶4+細(xì)胞，單克隆抗體混合物通常包括⑶14、⑶20、⑶11b、⑶16、 HLA-DR和⑶8的抗體。在某些實(shí)施方式中，可期望富集或陽性選擇通常表達(dá)⑶4+、⑶25+、 CD62Lhi、GITR+和FoxP3 +的調(diào)節(jié)T細(xì)胞?？蛇x地，在某些實(shí)施方式中，T調(diào)節(jié)細(xì)胞通過抗-C25 綴合珠或其它類似的選擇方法耗盡。
[0153] 對于通過陽性或陰性選擇分離期望的細(xì)胞群，可改變細(xì)胞和表面（例如，例如珠 的顆粒）的濃度。在某些實(shí)施方式中，可期望顯著減少其中珠和細(xì)胞被混合在一起的體積 (即，增加細(xì)胞濃度），以確保細(xì)胞和珠的最大接觸。例如，在一個實(shí)施方式中，使用20億細(xì) 胞/ml的濃度。在一個實(shí)施方式中，使用10億細(xì)胞/ml的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使 用多于1億細(xì)胞/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在還另一個實(shí)施方式中，使用75、80、85、90、95或100 X IO6細(xì)胞/ml 的細(xì)胞濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可使用125或150X IO6細(xì)胞/ml的濃度。使用高濃 度可導(dǎo)致增加的細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)展。進(jìn)一步，使用高細(xì)胞濃度允許更有效捕獲 可微弱表達(dá)感興趣的靶抗原的細(xì)胞，例如CD28-陰性T細(xì)胞，或捕獲來自有很多腫瘤細(xì)胞存 在的樣本（即白血病血液、腫瘤組織等）的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞群可具有治療價值并將期望 獲得。例如，使用高濃度的細(xì)胞允許更有效的選擇正常地具有更弱CD28表達(dá)的CD8+T細(xì)胞。
[0154] 在相關(guān)的實(shí)施方式中，可期望使用更低濃度的細(xì)胞。通過顯著稀釋T細(xì)胞和表面 (例如，例如珠的顆粒）的混合物，顆粒和細(xì)胞之間的相互作用被最小化。這樣選擇的細(xì)胞 表達(dá)高數(shù)量的待結(jié)合至顆粒的期望抗原。例如，在稀濃度，CD4+T細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞表達(dá)更 高水平的⑶28并更有效地被捕獲。在一個實(shí)施方式中，使用的細(xì)胞濃度為5 X IO6Ail。在 其他實(shí)施方式中，使用的濃度可從大約IXlOVml至IX IOfVml，和之間的任何整數(shù)值。
[0155] 在其它實(shí)施方式中，在旋轉(zhuǎn)器上，細(xì)胞可在2_37°C的任一個溫度下以變化的速度 溫育，持續(xù)變化的時間長度。
[0156] 在沖洗步驟后，用于刺激的T細(xì)胞也可被冷凍。不希望被理論所束縛，通過去除 細(xì)胞群中的粒細(xì)胞和以一定程度去除單核細(xì)胞，冷凍和隨后的解凍步驟提供了更均一的 產(chǎn)物。在去除血漿和血小板的沖洗步驟后，細(xì)胞可被懸浮在冷凍液中。盡管很多冷凍液 和參數(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并將在本內(nèi)容中是有用的，但一種方法包括使用包含20% DMSO和8 %人血清白蛋白的PBS，或包含10 %葡聚糖40和5 %右旋糖、20 %人血清白蛋白 和 7. 5% DMS0,或 31. 25% Plasmalyte-A、31. 25% 的右旋糖 5%、0· 45% NaCl、10%葡聚糖 40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7. 5% DMSO的培養(yǎng)基，或包含例如Hespan或噴他淀 粉和PlasmaLyte A的其它合適的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，細(xì)胞隨后被以Γ每分鐘的速率冷凍 至-80°C，并保存在液氮儲罐的蒸汽相中?？墒褂檬芸乩鋬龅钠渌椒ㄒ约霸赺20°C下或液 氮中不受控的即刻冷凍。
[0157] 在某些實(shí)施方式中，冷藏的細(xì)胞如本文所述的解凍和沖洗，并允許在使用本發(fā)明 的方法活化前在室溫下靜止1小時。
[0158] 在本發(fā)明的內(nèi)容下也考慮到的是在當(dāng)可能需要如本文所述的擴(kuò)展細(xì)胞前的時間 段，從對象收集血液樣本或單采血液成分術(shù)產(chǎn)物。因此，待擴(kuò)展的細(xì)胞的來源可在必要的 任何時間點(diǎn)收集，并且期望的細(xì)胞例如T細(xì)胞，被分離和冷凍，以便以后在T細(xì)胞治療中用 于將受益于T細(xì)胞治療的任何數(shù)量的疾病或病癥，例如本文所述的那些。在一個實(shí)施方式 中，血液樣本或單采血液成分術(shù)樣本取自大體健康的對象。在某些實(shí)施方式中，血液樣本 或單采血液成分術(shù)樣本取自處于患病風(fēng)險下但還沒有患病的大體健康的對象，并且感興趣 的細(xì)胞被分離和冷凍以便以后使用。在某些實(shí)施方式中，T細(xì)胞可在以后的時間被擴(kuò)展、 冷凍和使用。在某些實(shí)施方式中，在如本文所述的具體疾病的診斷后，但在任何治療前， 立刻從患者收集樣本。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在任何數(shù)量的有關(guān)治療形式前，從來自對 象的血液樣本或單采血液成分術(shù)樣本分離細(xì)胞，所述治療形式包括但不限于用以下試劑 治療：例如那他珠單抗（natalizumab)、厄法珠單抗（efalizumab)、抗病毒劑、化療、福射、 免疫抑制劑一一例如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506,抗體或其它免疫 燒蝕劑例如CAMPATH、抗-CD3抗體、環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、麥 考酚酸、類固醇類、FR901228和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶一一鈣調(diào)磷酸酶（環(huán) 孢菌素和FK506)或抑制對生長因子誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)重要的p70S6激酶（雷帕霉素 ）（Liu 等，Cell 66:807-815, 1991 ;Henderson 等，Immun. 73:316-321，1991 ;Bierer 等，Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，分離患者細(xì)胞并冷凍以便以后與 骨髓或干細(xì)胞移植、利用化療劑例如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法（XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體 例如0KT3或CAMPATH的T細(xì)胞燒蝕療法結(jié)合（例如，之前、同時或之后）使用。在另一個 實(shí)施方式中，細(xì)胞被分離，然后可被冷凍以便以后用于B-細(xì)胞燒蝕療法之后的治療，例如 與⑶20反應(yīng)的試劑，例如Rituxan。
[0159] 在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在治療后直接從患者獲得T細(xì)胞。在這點(diǎn)上，已 經(jīng)觀察到在某些癌癥治療后，特別是用損壞免疫系統(tǒng)的藥物治療后，在治療后不久，當(dāng)患者 將正常地從治療中恢復(fù)期間，獲得的T細(xì)胞的質(zhì)量對于其離體擴(kuò)展能力可以是最佳或改善 的。同樣地，在利用本文描述的方法離體操縱后，這些細(xì)胞可處于提高的移植物移入和體內(nèi) 擴(kuò)展的優(yōu)選狀態(tài)。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容內(nèi)考慮在該恢復(fù)期期間收集血液細(xì)胞，包括T細(xì) 胞、樹突細(xì)胞或造血系的其它細(xì)胞。進(jìn)一步，在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移（例如，用GM-CSF轉(zhuǎn) 移）和調(diào)節(jié)方案可用于在對象中創(chuàng)造以下條件，其中具體細(xì)胞類型的再群體化、再循環(huán)、再 生和/或擴(kuò)展是有利的，特別是在治療后限定的時間窗口期間。說明性的細(xì)胞類型包括T 細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞。
[0160] T細(xì)朐的活化和擴(kuò)展
[0161] 不論在T細(xì)胞基因修飾以表達(dá)期望的CAR之前或之后，T細(xì)胞都可通常使用以 下所述的方法活化和擴(kuò)展：例如美國專利6, 352, 694 ;6, 534, 055 ;6, 905, 680 ;6, 692, 964 ; 5, 858, 358 ；6, 887, 466 ；6, 905, 681 ；7, 144, 575 ；7, 067, 318 ；7, 172, 869 ；7, 232, 566 ； 7, 175, 843 ;5, 883, 223 ;6, 905, 874 ;6, 797, 514 ;6, 867, 041 ;和美國專利申請公布號 20060121005。
[0162] 通常，本發(fā)明的T細(xì)胞通過與表面的接觸進(jìn)行擴(kuò)展，所述表面具有附著于其上的 刺激CD3/TCR復(fù)合物相關(guān)信號的試劑和刺激T細(xì)胞表面上的共刺激分子的配體。特別地， T細(xì)胞群可如本文所述的例如通過與固定在表面上的抗-CD3抗體、或其抗原-結(jié)合片段 或抗-CD2抗體接觸，或通過和與鈣離子載體結(jié)合的蛋白激酶C激活劑（例如苔蘚抑制素） 接觸進(jìn)行刺激。對于T細(xì)胞表面上的輔助分子的共刺激，使用結(jié)合輔助分子的配體。例 如，T細(xì)胞群可在適于刺激T細(xì)胞增殖的條件下與抗-CD3抗體和抗-CD28抗體接觸。為 了刺激CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的增殖，使用抗-CD3抗體和抗-CD28抗體?？膳c在本領(lǐng)域 中公知的其他方法一樣，可使用包括9. 3、B-T3、XR-CD28 (Diacione，Besancon，F(xiàn)rance)的 抗-CD28 抗體的實(shí)例（Berg 等，Transplant Proc. 30 (8) : 3975-3977, 1998 ;Haanen 等，工 Exp. Med. 190 (9) : 13191328, 1999 ;Garland 等，J. Immunol Meth. 227 (1-2) : 53-63, 1999) 〇
[0163] 在某些實(shí)施方式中，T細(xì)胞的初級刺激信號和共刺激信號可通過不同的方案提供。 例如，提供每個信號的試劑可在溶液中或連接至表面。當(dāng)連接至表面時，試劑可被連接至同 一表面（即，以"cis"形式）或分開的表面（即，以"trans"形式）?？蛇x地，一種試劑可被 連接至表面且另一種試劑處于溶液中。在一個實(shí)施方式中，提供共刺激信號的試劑被結(jié)合 至細(xì)胞表面，并且提供初級活化信號的試劑在溶液中或被連接至表面。在某些實(shí)施方式中， 兩種試劑可都在溶液中。在另一個實(shí)施方式中，試劑可以以可溶形式，隨后被交聯(lián)至表面， 例如表達(dá)Fc受體或抗體的細(xì)胞或?qū)⒔Y(jié)合該試劑的其它結(jié)合劑。在這點(diǎn)上，見例如用于人造 抗原呈遞細(xì)胞（aAPC)的美國專利申請公布號20040101519和20060034810,其被考慮用于 活化和擴(kuò)展本發(fā)明的T細(xì)胞。
[0164] 在一個實(shí)施方式中，兩種試劑被固定在珠上，固定在同一珠即"cis"上或固定至分 開的珠即"trans"上。舉例說明，提供初級活化信號的試劑為抗-CD3抗體或其抗原-結(jié)合 片段，和提供共刺激信號的試劑為抗-CD28抗體或其抗原-結(jié)合片段；并且兩種試劑都以 相等的分子數(shù)量被共固定至同一珠。在一個實(shí)施方式中，使用結(jié)合至用于CD4+T細(xì)胞擴(kuò)展 和T細(xì)胞生長的珠的1 : 1比率的每種抗體。在本發(fā)明的某些方面中，使用一定比率的結(jié) 合至珠的抗⑶3 :⑶28抗體，以便與利用I : 1比率觀察到的擴(kuò)展相比，觀察T細(xì)胞擴(kuò)展 的增加。在一個具體的實(shí)施方式中，與利用1 : 1比率觀察到的擴(kuò)展相比，觀察到從大約1 至大約3倍的增加。在一個實(shí)施方式中，結(jié)合至珠的⑶3 :⑶28抗體的比率處于100 : 1 至1 : 100的范圍內(nèi)和其間的所有整數(shù)值。在本發(fā)明的一個方面中，比抗-CD3抗體更多的 抗-⑶28抗體被結(jié)合至顆粒，即⑶3 :⑶28的比率小于1。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中， 結(jié)合至珠的抗CD28抗體與抗CD3抗體的比率大于2 : 1。在一個具體的實(shí)施方式中，使用 結(jié)合至珠的抗體的1 : 100的⑶3 :⑶28比率。在另一個實(shí)施方式中，使用結(jié)合至珠的抗 體的1 : 75的⑶3 :⑶28比率。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1 : 50 的⑶3 :⑶28比率。在另一個實(shí)施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1 : 30的⑶3 :⑶28 比率。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1 : 10的⑶3 :⑶28比率。在另 一個實(shí)施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1 : 3的⑶3 :⑶28比率。在還另一個實(shí)施方式 中，使用結(jié)合至珠的抗體的3 : 1的⑶3 :⑶28比率。
[0165] 從1 : 500至500 : 1和其間任何整數(shù)值的顆粒與細(xì)胞的比率可用于刺激T細(xì)胞 或其它靶細(xì)胞。因?yàn)樵诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員可容易地領(lǐng)會到，顆粒與細(xì)胞的比率可取決于相對 于靶細(xì)胞的顆粒大小。例如，小尺寸的珠僅可結(jié)合一些細(xì)胞，而較大的珠能結(jié)合很多。在 某些實(shí)施方式中，細(xì)胞與顆粒的比率在1 : 100至100 : 1的范圍內(nèi)和其間任何整數(shù)值， 和在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該比率包括1 : 9至9 : 1和其間任何整數(shù)值，也可用于刺激T 細(xì)胞。產(chǎn)生T細(xì)胞刺激的抗-⑶3-和抗-⑶28-結(jié)合的顆粒與T細(xì)胞的比率可如以上記錄 的變化，然而某些優(yōu)選的值包括1 : 1〇〇、1 : 50、1 : 40、1 : 30、1 : 20、1 : 10、1 : 9、 1 : 8、1 : 7、1 : 6、1 : 5、1 : 4、1 : 3、1 : 2、1 : 1、2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、 7 : 1、8 : 1、9 : 1、10 : 1和15 : 1，一個優(yōu)選的比率為至少I : 1顆粒每個T細(xì)胞。在 一個實(shí)施方式中，使用1 : 1或更小的顆粒與細(xì)胞的比率。在一個具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選 的顆粒：細(xì)胞的比率為1 : 5。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，顆粒與細(xì)胞的比率可根據(jù)刺激天數(shù) 而改變。例如，在一個實(shí)施方式中，顆粒與細(xì)胞的比率在第一天為1 : 1至10 : 1，和額外 的顆粒在每天或此后每隔一天直至10天，以1 : 1至1 : 10的最終比率（基于添加日的 細(xì)胞計(jì)數(shù)）被添加至細(xì)胞。在一個具體的實(shí)施方式中，顆粒與細(xì)胞的比率在刺激的第一天 為I : 1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至1 : 5。在另一個實(shí)施方式中，顆粒在每天或每 隔一天的基礎(chǔ)上添加，以達(dá)到第一天I : 1的最終比率，和在刺激的第三和第五天1 : 5的 最終比率。在另一個實(shí)施方式中，顆粒與細(xì)胞的比率在刺激的第一天為2 : 1并在刺激的 第三和第五天被調(diào)節(jié)至1 : 10。在另一個實(shí)施方式中，顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添 加，以達(dá)到第一天1 : 1的最終比率，和在刺激的第三和第五天1 : 10的最終比率。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將理解多種其它比率可適于用于本發(fā)明。特別地，比率將根據(jù)顆粒大小以及細(xì) 胞大小和類型而變化。
[0166] 在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，例如T細(xì)胞的細(xì)胞，與包被試劑的珠組合，珠和細(xì) 胞隨后被分尚，并且隨后培養(yǎng)該細(xì)胞。在可選實(shí)施方式中，在培養(yǎng)前，不分尚包被試劑的珠 和細(xì)胞，而是在一起進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，珠和細(xì)胞首先通過施加例如磁力的 力被聚集，這導(dǎo)致增加的細(xì)胞表面標(biāo)記的連接作用，由此誘導(dǎo)細(xì)胞刺激。
[0167] 舉例說明，可通過允許附接抗-⑶3和抗-⑶28的順磁珠（3X28珠）以接觸T細(xì) 胞，來連接細(xì)胞表面蛋白。在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞（例如IO4至10 9個T細(xì)胞）和珠（例 如I : 1比率的DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T順磁珠）在優(yōu)選為PBS的緩沖液（沒 有例如鈣和鎂的二價陽離子）中組合。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易理解可使用任何細(xì)胞 濃度。例如，靶細(xì)胞可在樣本中非常稀少并僅占樣本的0.01%，或整個樣本（即，100%)可 包括感興趣的靶細(xì)胞。因此，任何細(xì)胞數(shù)量都在本發(fā)明的內(nèi)容中。在某些實(shí)施方式中，可期 望顯著降低顆粒和細(xì)胞混合在一起的體積（即，增加細(xì)胞濃度），以確保細(xì)胞和顆粒的最大 接觸。例如，在一個實(shí)施方式中，使用大約20億細(xì)胞/ml的濃度。在另一個實(shí)施方式中，使 用多于1億細(xì)胞/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。還在另一個實(shí)施方式中，使用75、80、85、90、95或100 X IO6細(xì)