采用一組snp的人身份識別的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請引入發(fā)明人為 John LeamoruMark Andersen 和 Michael Thornton 的、標題 為"用于多重PCR的方法和組合物"、于2012年4月27日提交的美國申請序列號13/458, 739 的全文作為參考。
技術領域
[0003] 在一些實施方案中，本公開內容一般性涉及擴增含有多個靶序列的樣品內的一個 或多個靶序列以識別人身份的方法、組合物、系統(tǒng)、設備和試劑盒。任選地，多個靶序列（例 如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或更多個序列）在單個擴增反應 內進行擴增。在一些實施方案中，本公開內容一般性涉及用于從單個來源（如基因組DNA、 福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE)DNA或法醫(yī)樣品）擴增一個或多個靶序列的方法、組合物、系 統(tǒng)、設備和試劑盒。具體地，公開了有效用于采用具有可切割基團的引物擴增一個或多個靶 序列的方法、試劑盒、系統(tǒng)、設備和組合物。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 幾種生物學應用設計在群體內選擇性擴增核酸分子。例如，下一代測序方法可設 計在大群核酸分子內選定靶標的分析。對于這樣的應用，增加在單個擴增反應內從群體選 擇性擴增的靶標的總數(shù)可能是有用的。這樣的選擇性擴增典型地通過能夠與特定靶核酸分 子選擇性雜交或選擇性促進其擴增的一個或多個引物的使用來實現(xiàn)。這樣的選擇性擴增可 能由于擴增假體（artifact)的形成（如引物二聚體等）而變得復雜。這樣的擴增假體的 形成（本文也稱為非特異性擴增產物）可以消耗關鍵擴增試劑，例如，核苷酸、聚合酶、引物 等。另外，這樣的假體可相對于預期產物頻繁具有更短的長度，在這樣的情況下可比預期產 物更有效地擴增并支配反應輸出。選擇性擴增還可能由于'超級擴增子'的形成（即延長 的擴增子的形成）而變得復雜，其可以在第一引物的延伸通過相鄰的靶核酸序列延長時發(fā) 生，從而創(chuàng)造長的非特異性擴增產物，其可以作為與第二引物延伸的模板。在擴增反應中這 樣的假體的形成，即使當僅采用單個引物對時，可以使得下游應用（如qPCR、克隆、基因表 達分析和用于下一代測序的樣品制備）復雜化。因為該假體會在二次擴增過程中被進一步 放大，所以在一些下游應用中，包括幾種下一代測序方法，這樣的問題會由于要求進行二次 擴增步驟而被加重。例如，下游測序應用可以涉及克隆擴增的核酸群體的產生，其被分別附 著到分離的支持物（如珠），采用乳液PCR( "emPCR"）和通過陽性選擇所進行的針對克隆 擴增子的富集。在這樣的應用中，該假體可以通過文庫產生過程一路被帶到emPCR階段，產 生包括非特異性擴增產物的DNA捕獲珠。用含有模板的珠在富集過程中可以選擇這些含有 假體的珠，但它們是遺傳上無信息的。
[0006] 在多重PCR反應中擴增的核酸分子可以在有或者沒有進一步純化或操作的情況 下被用于多個下游分析或測定。例如，以足夠的產率獲得的多重PCR反應的產物（擴增子） 可以被用于單核苷酸多態(tài)性（SNP)分析、基因分型、拷貝數(shù)變異分析、表觀遺傳分析、基因 表達分析、雜交陣列、基因突變的分析（包括但不限于疾病狀態(tài)的檢測、預后和/或診斷）、 稀有或低頻等位基因突變的檢測和分析、核酸測序（包括但不限于從頭（de novo)測序或 靶向重新測序）等。
[0007] 不例性下一代測序系統(tǒng)包括Ion Torrent PGM?測序儀（Life Technologies)和 Ion Torrent Proton?測序儀（Life Technologies),其為基于離子的測序系統(tǒng)，其通過檢 測作為核苷酸摻入的副產物所產生的離子來對核酸模板進行測序。典型地，氫離子是作為 在通過聚合酶進行模板依賴性核酸合成過程中發(fā)生的核苷酸摻入的副產物而釋放的。Ion Torrent PGM?測序儀和離子質子TE?J序儀通過檢測核苷酸摻入的氫離子副產物來檢測核 苷酸摻入。Ion Torrent PGM?測序儀和離子質子，則序儀包括要被測序的多個核酸模板， 每個模板位于陣列中各自測序反應孔內。陣列的每個孔偶聯(lián)了至少一個離子傳感器，其能 夠檢測作為核苷酸摻入的副產物所產生的H +離子的釋放或溶液pH的變化。離子傳感器包 含場效應晶體管（FET)，其被偶聯(lián)至能夠感知H+離子的存在或溶液pH的變化的離子敏感性 檢測層。該離子傳感器提供指示核苷酸摻入的輸出信號，其可表示為幅度與各自孔或反應 室中的H +離子濃度相關的電壓變化。不同類型的核苷酸被連續(xù)流入該反應室，并且通過聚 合酶以由模板的序列所確定的順序被摻入延伸的引物（或聚合位點）。每個核苷酸摻入伴 隨反應孔中H +離子的釋放，以及伴隨的局部pH的變化。H +離子的釋放由傳感器的FET記 錄，其產生指示核苷酸摻入的發(fā)生的信號。在特定的核苷酸流的過程中沒有被摻入的核苷 酸不會產生信號。來自FET的信號的振幅還可以與摻入延伸的還是分子的特定類型的核 苷酸數(shù)目相關，從而運行均聚物區(qū)域要被解析。因此，在測序儀運行過程中，與跨多個孔或 反應室的摻入監(jiān)測一起，進入反應室的多個核苷酸流允許儀器同時解析多個核酸模板的序 列。關于Ion Torrent PGM?測序儀的組成、設計和操作的進一步的細節(jié)可以見于例如美 國專利申請序列號12/002781(現(xiàn)在以美國專利公開號2009/0026082公開）、美國專利申 請序列號12/474897(現(xiàn)在以美國專利公開號2010/0137143公開）和美國專利申請序列 號12/492844(現(xiàn)在以美國專利公開號2010/0282617公開），所有這些申請全文作為參考 引入。在一些實施方案中，擴增子可以通過橋擴增或emPCR被操作或擴增以產生多個克隆 模板，其適于各種下游過程（process)(包括核酸測序）。在一個實施方案中，要被采用Ion Torrent PGM?或Ion Torrent Proton?系統(tǒng)測序的核酸模板可以采用本文所述的祀特異 性擴增技術中的一個或多個從核酸分子群體進行制備。任選地，接著靶特異性擴增，可以進 行二次和/或三級擴增過程包括但不限于文庫擴增步驟和/或克隆擴增步驟（如emPCR)。
[0008] 當所期望的（desired)在樣品核酸群體內擴增的核酸靶標的數(shù)量增加時，選擇性 擴增這些靶標同時避免不期望的擴增假體的挑戰(zhàn)會相應增加。例如，包括引物二聚體和超 級擴增子的假體的形成在針對多個靶標的PCR引物被合并在單個反應管中并且共擴增的 多重PCR反應中會是更大的問題。在多重PCR中，以相對于模板DNA提高的濃度的另外的 引物對的存在使得引物-引物發(fā)生相互作用，并且更容易形成引物二聚體和其它假體。
[0009] 目前在核酸擴增過程中用于避免或減少假體（如引物二聚體）形成的方法以包 圍引物設計過程為中心，并經常利用專門的軟件包（例如，DNA軟件的可視0MP、MultiPLX、 ΑΒΓ S Primer Express等）來設計引物對，其被預測為在擴增過程中在池（pool)中顯示 與其它引物之間最小的相互作用。通過使用這樣的軟件，引物可以被設計為盡可能地靶特 異性或擴增子特異性，并經常被分組成子集以盡量減少引物-引物相互作用、引物二聚體 形成和超級擴增子。但是，嚴格的設計參數(shù)限制了可被同時共擴增的擴增子的數(shù)量，并且在 一些情況下可能干脆阻止一些擴增子的擴增。目前的其它方法需要使用多個PCR引物池以 將引物分隔成不重疊的池以盡量減少或阻止擴增步驟過程中的引物假體。其它方法包括使 用多個引物池或單個復雜反應來增強每個反應的擴增產物的總產率。在多重PCR反應中， 每個引物對在擴增反應中與另外的引物對爭奪有限量的dNTPs、聚合酶和其它試劑。因此， 需要改善的方法、組合物、系統(tǒng)、設備和試劑盒，其允許在核酸分子群體內選擇性擴增多個 靶核酸分子，同時避免或盡量減少假體（也稱作非特異性擴增產物）（包括引物二聚體）的 形成。還需要改善的方法、組合物、系統(tǒng)、設備和試劑盒，其允許從單個核酸樣品（如基因組 DNA和/或）福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE)DNA選擇性擴增多個靶核酸分子，同時避免或盡 量減少假體的形成。本領域還需要改善的方法、組合物、系統(tǒng)和試劑盒，其允許在單個反應 中同時擴增成千上萬的靶特異性核酸分子，其可以被用于任何可適用的下游測定或分析。 [0010] 除非另外指出，否則本主題的實施可以采用有機化學、分子生物學（包括重組技 術）、細胞生物學和生物化學的常規(guī)技術和說明，其是在本領域的技術范圍內的。這樣的 常規(guī)技術包括但不限于合成多核苷酸的制備、聚合技術、聚合物顆粒的化學和物理分析、核 酸文庫的制備、核酸測序和分析等。合適的技術的具體說明參考本文所提供的例子進行使 用。也可以使用其它等效的常規(guī)操作。這樣的常規(guī)技術和說明可見于標準實驗室手冊，如 Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols. I-IV)、PCR Primer:A Laboratory Manual, and Molecular Cloning:A Laboratory Manual (均來自 Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Hermanson, Bioconjugate Techniques, Second Edition(Academic Press,2008) ；Merkus, Particle Size Measurements(Springer,2009) ；Rubinstein and Colby, Polymer Physics (Oxford University Press, 2003)等。 toon] 除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬技術領域 普通技術人員通常所理解的相同的含義。本文所引用的所有專利、專利申請、公開的申請、 論文和其它出版物（上文和下文），全文都作為參考引入。如果本文所述的定義和/或說明 與本文作為參考引入的專利、專利申請、公開的申請和其它出版物所述任何定義相反或以 其它方式不一致，本文所述的定義和/或說明優(yōu)先于作為參考引入的定義。
[0012] 如本文所用，術語"包含（comprises) "、"包含（comprising) "、"包括 (includes) "、"包括（including) "、"具有（has) "、"具有（having) "或其任何其它變體，旨 在涵蓋非排他性的包括。例如，包含一系列特征的過程、方法、物品或設備不必僅限制于那 些特征但可以包括這樣的過程、方法、物品或設備的未明確列出或固有的其它特征。另外， 除非明確有相反的說明，否則"或（or)"是指包含性的或而不是排他性的或。例如，條件A 或B由以下任意一種情況滿足:A是真（或存在）且B是假（或不存在）、A是假（或不存 在）且B是真（或存在）和A和B均是真（或存在）。
[0013] 本文所用的章節(jié)標題僅用于組織性目的，并且不應當被解釋為以任何方式限制所 述主題。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 在本發(fā)明的一個方面，提供了被配置為與人基因組的一組SNP區(qū)域特異性雜交的 多個引物對，其中所述SPN區(qū)域的組選自表1的SNP區(qū)域，并且其中至少一個引物對中的至 少一個引物包含可切割的核苷酸。在一些實施方案中，所述多個引物對被配置為與表1的 條目1-136的一組SNPs雜交。在其它實施方案中，所述多個引物對被配置為與表1的條目 1-103的一組SNPs雜交。在又一些其它實施方案中，所述至少一個引物對中的至少一個引 物包含可切割的尿嘧啶核苷酸。
[0016] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于擴增樣品內的多個不同靶序列的方法，其包 括以下步驟：在單個擴增反應混合物內從包括多個不同靶序列的樣品擴增所述多個不同靶 序列，其中所述擴增包括在擴增條件下將所述樣品中的至少一些部分接觸多個靶特異性引 物和聚合酶，從而產生擴增的多個靶序列，其中不同擴增的靶序列中的至少兩個是彼此小 于50 %互補的，并且其中所述多個靶特異性引物中的至少一個和所述擴增的靶序列中的 至少一個包括可切割的基團；切割所擴增的多個靶序列中的至少一個擴增的靶序列的可切 割的基團；在平端連接反應中將至少一個接頭連接至至少一個擴增的靶序列，從而產生一 個或多個接頭連接的擴增的靶序列，以及再擴增所述接頭連接的擴增的靶序列中的至少一 個。
[0017] 在一些實施方案中，所述至少一個接頭中的一個或多個基本上不與至少一個擴增 的靶序列互補。在其它實施方案中，所述再擴增包括在擴增條件下將所述至少一個接頭連 接的擴增的靶序列與包括與所述接頭或它們的互補序列中的至少一個互補的序列的一個 或多個引物和聚合酶接觸，從而產生至少一個再擴增的接頭連接的擴增的靶序列。在又一 些其它實施方案中，所述一個或多個接頭或它們的互補序列中的至少一個基本上不與至少 一個擴增的靶序列互補。本發(fā)明還提供了基本上與所述樣品中的相應靶序列的至少一部分 基本上互補的至少一個靶特異性引物。在其它實施方案中，被連接至所述擴增的靶序列中 的至少一個的接頭易受核酸外切酶消化。在又一些其它實施方案中，被連接至所述擴增的 靶序列中的至少一個的接頭不包括保護性基團。在又一些其它實施方案中，所述連接步驟 包括在連接條件下將具有3'端和5'端的至少一個擴增的靶序列與包括一個或多個接頭和 連接酶的連接反應混合物接觸，其中，在所述連接之前，所述連接反應混合物中的所述接頭 沒有一個包括靶特異性序列。本發(fā)明還提供了所述連接步驟包括在連接條件下將至少一個 擴增的靶序列與包括一個或多個接頭和連接酶的連接反應混合物接觸，其中，在將所述一 個或多個接頭連接到至少一個擴增的靶序列之前，所述連接反應混合物不