旦被連接至接頭，所 述擴(kuò)增的靶序列可以進(jìn)行切口平移反應(yīng)和/或進(jìn)一步的擴(kuò)增以產(chǎn)生接頭連接的擴(kuò)增的靶 序列的文庫。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及多個靶特異性擴(kuò)增子的制備和形成。在 一些實(shí)施方案中，所述方法包括將一個或多個靶特異性引物對雜交至核酸分子，延伸所述 引物對的第一引物，從所述核酸分子變性所延伸的第一引物，將所述延伸的第一引物產(chǎn)物 與所述引物對的第二引物雜交并延伸所述第二引物，消化所述靶特異性引物對以產(chǎn)生多個 靶特異性擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行切口平移反應(yīng)之前接頭可以被連接至所述靶 特異性擴(kuò)增子的末端以產(chǎn)生適于核酸測序的多個靶特異性擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方案中，所 述一個或多個靶特異性擴(kuò)增子可以采用橋擴(kuò)增或emPCR被擴(kuò)增以產(chǎn)生適用于核酸測序的 多個克隆模板。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于準(zhǔn)備靶特異性擴(kuò)增子文庫的 方法，用于各種下游過程或測定（如核酸測序或克隆擴(kuò)增）。在一些實(shí)施方案中，本公開 內(nèi)容涉及采用具有可切割的基團(tuán)的引物，對具有多個靶序列的核酸樣品進(jìn)行靶特異性多重 PCR的方法。
[0082] 在一個實(shí)施方案中，要被采用Ion Torrent PGM?或Ion Torrent Proton?系統(tǒng)測 序的核酸模板可以采用本文所述的靶特異性擴(kuò)增技術(shù)從核酸分子群體進(jìn)行制備。任選地， 在靶特異性擴(kuò)增之后可以進(jìn)行二級和/或三級擴(kuò)增過程包括但不限于文庫擴(kuò)增步驟和/或 克隆擴(kuò)增步驟（如emPCR)。
[0083] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及包含多個靶特異性引物對的組合物，每個含 有正向引物和反向引物，其具有位于a)3'端或5'端，和/或b)所述靶特異性引物的大約中 央核苷酸的位置的至少一個可切割的基團(tuán)，并且其中所述靶特異性引物對可以與所述組合 物中的其它引物對基本上非互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含至少10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、110、120、130個或更多個靶特異性引物對。在一些實(shí)施方案中，所述 靶特異性引物對包含長度為大約15個核苷酸到大約40個核苷酸，其中至少一個核苷酸被 替換為可切割的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述可切割的基團(tuán)可以是尿苷核苷酸。在一些 實(shí)施方案中，所述靶特異性引物組被設(shè)計為擴(kuò)增多于一個單核苷酸多態(tài)性（SNP)，并且在一 些實(shí)施方案中，所述靶特異性引物組被設(shè)計為擴(kuò)增一組SNPs。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)如本文 所述與靶序列雜交并擴(kuò)增時，所述靶特異性引物對能夠產(chǎn)生長度大約100個至大約500個 堿基對的接頭連接的擴(kuò)增的靶序列的文庫。在一些實(shí)施方案中，與所述文庫中剩余的接頭 連接的擴(kuò)增的靶序列相比，沒有一個接頭連接的擴(kuò)增的靶序列在所述文庫中被過表達(dá)大于 30%。在一些實(shí)施方案中，所述接頭連接的擴(kuò)增的靶序列文庫就GC含量、擴(kuò)增的靶序列長 度或解鏈溫度（Tm)而言基本上是均勻的（homogenous)。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于進(jìn)行多重PCR的試劑盒，其包含具 有可切割的基團(tuán)的多個靶特異性引物、DNA聚合酶、接頭、dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在一些 實(shí)施方案中，所述可切割的基團(tuán)可以是尿嘧啶核苷酸。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一種或 多種抗體、核酸條形碼、純化溶液或柱。
[0085] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于產(chǎn)生靶特異性擴(kuò)增子文庫的試劑 盒，其包含具有可切割的基團(tuán)的多個靶特異性引物、DNA聚合酶、接頭、dATP、dCTP、dGTP、 dTTP和切割試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一種或多種抗體、核酸條 形碼、純化溶液或柱。
[0086] 在一個實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及從單個核酸來源或樣品的多個靶特異性 序列的擴(kuò)增。在另一個實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及從兩個或更多個核酸來源、樣品或 物質(zhì)的兩個或更多個靶序列的靶特異性擴(kuò)增。例如，可以由本公開內(nèi)容想到的是，單個核酸 樣品可以包括基因組DNA或福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE)DNA。還可以想到的是，所述樣品 可以來自單個個體、來自遺傳相關(guān)成員的核酸樣品的集合、來自遺傳不相關(guān)的成員的多個 核酸樣品、來自單個個體的多個核酸樣品（匹配的）（如腫瘤樣品和正常組織樣品）、來自含 有兩個不同形式的遺傳物質(zhì)的單個來源的遺傳物質(zhì)（如從母體受試者獲得的母體和胎兒 DNA)、或含有植物或動物DNA的樣品中污染的細(xì)菌DNA的存在。在一些實(shí)施方案中，所述核 酸物質(zhì)來源可以包括從新生兒獲得的核酸，例如如典型地作為用于新生兒篩查的血液樣品 所獲得的。
[0087] 所述核酸樣品可以包括高分子量物質(zhì)（如基因組DNA或cDNA)。所述樣品可以包 括低分子量物質(zhì)（如從FFPE或存檔的DNA樣品獲得的核酸分子）。在另一個實(shí)施方案中， 低分子量物質(zhì)包括酶法或機(jī)械剪切的DNA。所述樣品可以包括無細(xì)胞的循環(huán)DNA (如從母體 受試者獲得的物質(zhì)）。在一些實(shí)施方案中，所述樣品可以包括從活檢、腫瘤、刮片、拭子、血 液、粘液、尿液、血漿、精液、毛發(fā)、激光捕獲顯微切片、手術(shù)切除物和其它臨床或?qū)嶒炇耀@得 的樣品獲得的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，所述樣品可以包括法醫(yī)樣品。
[0088] 在一些實(shí)施方案中，所述樣品可以包括從人類來源所獲得的核酸分子。在其它實(shí) 施方案中，所述樣品可以具有從人獲得的核酸分子并還含有來自植物、細(xì)菌、病毒、真菌或 非人動物的污染核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子來源可以是存檔的或滅絕的樣品 或物種。
[0089] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及來自組織、活檢、核（core)、腫瘤、流體、 法醫(yī)或其它生物樣品的至少一種靶序列的選擇性擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通 常涉及樣品中至少一種靶序列的選擇性擴(kuò)增和突變的檢測和/或識別。在一些實(shí)施方案 中，所述樣品可以包括全基因組DNA、福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE)、剪切的或酶法處 理的DNA。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及至少一種靶序列的選擇性擴(kuò)增和臨床可操作 的突變的檢測和/或識別。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及與藥物抗性或藥物敏感性 相關(guān)的突變的檢測和/或識別。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及與器官移植或器 官排斥相關(guān)遺傳標(biāo)志物的識別和/或定量。
[0090] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及無細(xì)胞的循環(huán)DNA中至少一種靶序列的 選擇性擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，樣品中所述至少一種靶序列的選擇性擴(kuò)增包括不同核酸 分子的混合物。所述選擇性擴(kuò)增可以任選地伴隨著循環(huán)DNA中所觀察到的突變的檢測和/ 或識別。在一些實(shí)施方案中，所述選擇性擴(kuò)增可以任選地伴隨著與癌癥或遺傳性疾?。ㄈ?代謝、神經(jīng)肌肉、發(fā)育、心血管、自身免疫性或其它遺傳疾?。┫嚓P(guān)的突變的檢測和/或識 別。
[0091] 在一些實(shí)施方案中，所述靶特異性引物和引物對是能夠擴(kuò)增核酸分子的特定區(qū)域 的靶特異性序列。在一些實(shí)施方案中，所述靶特異性引物可以擴(kuò)增基因組DNA或cDNA。在 一些實(shí)施方案中，所述靶特異性引物可以擴(kuò)增哺乳動物DNA，如人類DNA。在一些實(shí)施方案 中，選擇性擴(kuò)增所需要的DNA的量可以從大約Ing到1微克。在一些實(shí)施方案中，一種或多 種靶序列的選擇性擴(kuò)增所需的DNA的量可以是大約lng、大約5ng或大約10ng。在一些實(shí) 施方案中，靶序列的選擇性擴(kuò)增所需要的DNA的量是大約IOng至大約200ng。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，至少一種靶序列的選擇性擴(kuò)增進(jìn)一步包括擴(kuò)增的靶序列的核 酸測序。任選地，所述方法進(jìn)一步包括通過擴(kuò)增的靶序列的核酸測序識別的樣品中存在的 突變的檢測和/或識別。在一個實(shí)施方案中，所述突變可以包括取代、插入、倒位、點(diǎn)突變、 缺失、錯配和易位。在一個實(shí)施方案中，所述突變可以包括在拷貝數(shù)上的變異。在一個實(shí)施 方案中，所述突變可以包括生殖系或體細(xì)胞突變。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，靶特異性引物采用本文所公開的引物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計。
[0094] 在一些實(shí)施方案中，靶序列或擴(kuò)增的靶序列涉及從法醫(yī)樣品獲得的核酸。在一個 實(shí)施方案中，法醫(yī)樣品可以包括從犯罪現(xiàn)場獲得的核酸、從失蹤人員DNA數(shù)據(jù)庫獲得的核 酸、從與法醫(yī)調(diào)查相關(guān)的實(shí)驗室獲得的核酸或包括通過執(zhí)法機(jī)構(gòu)、一個或多個軍事部門或 任何這樣的部門獲得的法醫(yī)樣品。在一些實(shí)施方案中，祀序列可以存在于一種或多種體液 中，包括但不限于血液、痰液、血漿、精液、尿液和血清。在一些實(shí)施方案中，靶序列可以從受 害者的毛發(fā)、皮膚、組織樣品、尸檢或遺體獲得。在一些實(shí)施方案中，包括一種或多種靶序列 的核酸可以從死亡的動物或人獲得。在一些實(shí)施方案中，靶序列可以包括從非人DNA(如微 生物、植物或昆蟲DNA)獲得的核酸。在一些實(shí)施方案中，靶序列或擴(kuò)增的靶序列涉及人身 份識別（human identification)的目的。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于識 別來自動物（包括人）的核酸樣品的方法。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于 識別法醫(yī)樣品的特征的方法。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及采用本文所公開的 一種或多種靶特異性引物或采用本文所述引物標(biāo)準(zhǔn)制備的一種或多種靶特異性引物的身 份識別方法。
[0095] 在一個實(shí)施方案中，含有至少一種靶序列的法醫(yī)或人身份識別樣品可以使用采用 本文所述的引物標(biāo)準(zhǔn)所設(shè)計的任意一種或多種靶特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案 中，含有一種或多種靶序列的法醫(yī)或人身份識別樣品可以通過用被設(shè)計為擴(kuò)增如表1所示 的與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)染色體的一個或多個區(qū)域的任意一種或多種靶特異性引物擴(kuò)增 所示至少一種或多種靶序列進(jìn)行識別。至于每個所公開的SNP的參考SNP簇記錄（rs#)、 NCBI參考序列或上傳者的參考號（GenBank登錄號）和所述SNP的染色體位置（萬維網(wǎng)網(wǎng) 址 ncbi. nlm. nih. gov/pro jects/SNP/)，請參見表 A。
[0096] 表L含有身份識別有用的SNPs的區(qū)域。
[0097]
【主權(quán)項】
1. 用于擴(kuò)增樣品內(nèi)的多個不同靶序列的方法，其包括： 在單個擴(kuò)增反應(yīng)混合物內(nèi)從包括多個不同靶序列的樣品擴(kuò)增所述多個不同靶序列，其 中所述擴(kuò)增包括在擴(kuò)增條件下將所述樣品的至少一些部分接觸多個靶特異性引物和聚合 酶，從而產(chǎn)生擴(kuò)增的多個靶序列，其中不同擴(kuò)增的靶序列中的至少兩個是彼此小于50%互 補(bǔ)的，并且其中所述多個靶特異性引物中的至少一個和所述擴(kuò)增的靶序列中的至少一個包 括可切割的基團(tuán)； 切割所擴(kuò)增的多個靶序列中的至少一個擴(kuò)增的靶序列的可切割的基團(tuán)； 在平端連接反應(yīng)中將至少一個接頭連接至至少一個擴(kuò)增的靶序列，從而產(chǎn)生一個或多 個接頭連接的擴(kuò)增的靶序列，以及 再擴(kuò)增所述接頭連接的擴(kuò)增的靶序列中的至少一個。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個接頭中的一個或多個基本上不與至少 一個擴(kuò)增的靶序列互補(bǔ)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述再擴(kuò)增包括在擴(kuò)增條件下將所述至少一個接頭 連接的擴(kuò)增的靶序列與包括與所述接頭或它們的互補(bǔ)序列中的至少一個互補(bǔ)的序列的一 個或多個引物和聚合酶接觸，從而產(chǎn)生至少一個再擴(kuò)增的接頭連接的擴(kuò)增的靶序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一個或多個接頭或它們的互補(bǔ)序列中的至少一 個基本上不與至少一個擴(kuò)增的靶序列互補(bǔ)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一個靶特異性引物與所述樣品中的相應(yīng)靶序列 的至少一部分基本上互補(bǔ)。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中連接至所述擴(kuò)增的靶序列中的至少一個的接頭易受 核酸外切酶消化。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中連接至所述擴(kuò)增的靶序列中的至少一個的接頭不包 括保護(hù)性基團(tuán)。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述連接包括在連接條件下將具有3'端和5'端的 至少一個擴(kuò)增的祀序列與包括一個或多個接頭和連接酶的連接反應(yīng)混合物接觸，其中，在 所述連接之前，所述連接反應(yīng)混合物中的所述接頭沒有一個包括靶特異性序列。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述連接包括在連接條件下將至少一個擴(kuò)增的靶序 列與包括一個或多個接頭和連接酶的連接反應(yīng)混合物接觸，其中，在將所述一個或多個接 頭連接至至少一個擴(kuò)增的靶序列之前，所述連接反應(yīng)混合物不包括一個或多個另外的寡核 苷酸接頭。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增在所述連接之前進(jìn)一步包括消化步驟，從 而產(chǎn)生多個具有5'磷酸基團(tuán)的平端擴(kuò)增的靶序列。
11. 配置為與人基因組的一組SNP區(qū)域特異性雜交的多個引物對，其中所述一組SNP區(qū) 域選自表1的SNP區(qū)域，并且其中至少一個引物對中的至少一個引物包含可切割的核苷酸。
12. 多個引物對，其中一組SNP包含表1的條目1-136。
13. 多個引物對，其中一組SNP包含表1的條目1-103。
【專利摘要】本發(fā)明提供了對一個或多個核酸的多重PCR有用的方法、組合物、試劑盒、系統(tǒng)和設(shè)備，所述一個或多個核酸屬于用于識別人身份的一組單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。具體地，提供了允許選擇性擴(kuò)增該組中的一個或多個靶序列的各種靶特異性引物。在一些方面，采用所公開的方法、試劑盒、系統(tǒng)和設(shè)備獲得的擴(kuò)增的靶序列可以被用于包括核酸測序的各種下游過程并可以被用于識別人身份。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104619863
【申請?zhí)枴緾N201380046949
【發(fā)明人】R·拉伽斯
【申請人】生命技術(shù)公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2013年7月15日
【公告號】EP2872650A2, WO2014012107A2, WO2014012107A3