酸可以被表示為 所述寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或者可以被提供為鄰近所述未連接的3'羥基的 多個(gè)連接的核苷酸。例如，所述3'端可以包括所述寡核苷酸的小于50%的核苷酸長度。在 一些實(shí)施方案中，所述3'端不包括任何未連接的3'羥基基團(tuán)而是可以包括能夠通過引物 延伸和/或核苷酸聚合作為核苷酸附著的位點(diǎn)的任何部分。在一些實(shí)施方案中，所述術(shù)語 "3'端"，例如當(dāng)指靶特異性引物時(shí)，可以包括3'端的末端10個(gè)核苷酸、末端5個(gè)核苷酸、末 端4、3、2個(gè)或更少的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述術(shù)語"3'端"當(dāng)指靶特異性引物時(shí)可 以包括位于離所述3'末端的核苷酸位置10或更少的核苷酸。
[0066] 如本文所用，"5'端"及其衍生詞，通常是指核酸分子（例如，靶序列或擴(kuò)增的靶序 列）的端部，其包括游離的5'磷酸基團(tuán)或其等價(jià)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述5'端包括 沒有被連接至相鄰的單核苷酸戊糖環(huán)的3'羥基的5'磷酸基團(tuán)。典型地，所述5'端包括鄰 近于所述5'磷酸基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)連接的核苷酸，典型地鄰近于包括所述5'磷酸基團(tuán)的 所述核苷酸的30個(gè)核苷酸，典型地末端20個(gè)并且甚至更典型地末端15個(gè)核苷酸。通常， 所述一個(gè)或多個(gè)連接的核苷酸可以被表示為所述寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或者 可以被提供為鄰近所述5'磷酸的多個(gè)連接的核苷酸。例如，所述5'端可以是小于50%的 所述核苷酸長度的寡核苷酸。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，所述5'端可以包括與包括所 述末端5'磷酸的核苷酸相鄰的大約15個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述5'端不包括任 何未連接的5'磷酸基團(tuán)而是可以包括能夠作為3'羥基基團(tuán)或另一個(gè)核酸分子的3'端的 附著位點(diǎn)的任何部分。在一些實(shí)施方案中，所述術(shù)語"5'端"，例如當(dāng)指靶特異性引物時(shí)，可 以包括5'端的末端10個(gè)核苷酸、末端5個(gè)核苷酸、末端4、3、2個(gè)或更少的核苷酸。在一些 實(shí)施方案中，所述術(shù)語"5'端"當(dāng)指靶特異性引物時(shí)可以包括位于離所述5'端的核苷酸位 置10或更少的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，靶特異性引物的5'端可以僅包括非可切割的 核苷酸，例如，不含有如本文所公開的一個(gè)或多個(gè)可切割的基團(tuán)，或如可以由本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員很容易地確定的可切割的核苷酸。
[0067] 如本文所用，"保護(hù)基團(tuán)"及其衍生詞，通常是指能夠被摻入接頭或靶特異性引物 的任何部分，其賦予化學(xué)選擇性或保護(hù)所述靶特異性引物或接頭不被消化或化學(xué)降解。典 型地，但不是必須的，保護(hù)基團(tuán)可以包括在所述靶特異性引物或接頭中的現(xiàn)有官能團(tuán)的修 飾以實(shí)現(xiàn)化學(xué)選擇性。合適類型的保護(hù)基團(tuán)包括醇、胺、磷酸、羰基或羧酸保護(hù)基團(tuán)。在示 例性的實(shí)施方案中，所述保護(hù)基團(tuán)可以包括具有碳原子鏈的間隔（spacer)化合物。
[0068] 如本文所用，"DNA條形碼"或"DNA標(biāo)簽序列"及其衍生詞，通常是指接頭內(nèi)的獨(dú) 特的短（6-14個(gè)核苷酸）核酸序列，其可以作為樣品內(nèi)區(qū)分或分離多個(gè)擴(kuò)增的靶序列的'鑰 匙（key) '。對于本公開內(nèi)容的目的來說，DNA條形碼或DNA標(biāo)簽序列可以被摻入接頭的核 苷酸序列。
[0069] 如本文所用，短語"兩個(gè)循環(huán)的靶特異性雜交"或"兩個(gè)循環(huán)的靶特異性選擇"及其 衍生詞通常是指任何過程，由此相同的靶序列進(jìn)行連續(xù)兩個(gè)循環(huán)的基于雜交的靶特異性選 擇，其中靶序列與靶特異性序列雜交?；陔s交的靶特異性選擇的每個(gè)循環(huán)可以包括與靶 特異性序列的至少一些部分的多個(gè)靶特異性雜交。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，靶特異性 選擇的循環(huán)包括涉及所述靶序列的第一區(qū)域的第一靶特異性雜交和涉及所述靶序列的第 二區(qū)域的第二靶特異性雜交。所述第一和第二區(qū)域可以是相同的或不同的。在一些實(shí)施方 案中，基于雜交的靶特異性選擇的每個(gè)循環(huán)可以包括使用兩個(gè)靶特異性寡核苷酸（例如， 正向靶特異性引物和反向靶特異性引物），使得每個(gè)循環(huán)的尋找包括兩個(gè)靶特異性雜交。
[0070] 如本文所用，"可比最高最低解鏈溫度"及其衍生詞，通常是指所述可切割的基團(tuán) 切割之后每個(gè)核酸片段針對單個(gè)接頭或靶特異性引物的解鏈溫度（Tm)。比較由單個(gè)接頭或 靶特異性引物所產(chǎn)生的每個(gè)核酸片段的雜交溫度來確定阻止任何核酸片段與所述靶特異 性引物或接頭至所述靶序列的雜交所需要的最高最低溫度。一旦知曉最高雜交溫度，則可 以操縱（manipulate)所述接頭或靶特異性引物（例如通過沿著引物長度移動(dòng)可切割的基 團(tuán)的位置）來實(shí)現(xiàn)針對每個(gè)核酸片段的可比最高最低解鏈溫度。
[0071] 如本文所用，"僅添加（additiononly) "及其衍生詞，通常是指一系列步驟，其中試 劑和組分被加入第一或單個(gè)反應(yīng)混合物。典型地，為了完成所述一系列步驟，所述一系列步 驟排除從第一容器取出所述反應(yīng)混合物至第二容器。通常，僅添加過程排除在含有所述反 應(yīng)混合物的容器之外操作所述反應(yīng)混合物。典型地，僅添加過程適于自動(dòng)化和高通量。
[0072] 如本文所用，"合成（synthesizing) "及其衍生詞，通常是指涉及通過聚合酶的 核苷酸聚合的反應(yīng)，任選地以模板依賴性的形式。聚合酶通過將核苷單磷酸從核苷三磷酸 (NTP)、脫氧核苷三磷酸（dNTP)或雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP)轉(zhuǎn)移至延伸的寡核苷酸鏈的 3'羥基來合成寡核苷酸。對于本公開內(nèi)容的目的來說，合成包括通過來自脫氧核苷三磷酸 的核苷單磷酸的轉(zhuǎn)移的雜交的接頭或祀特異性引物的系列延伸（serial extension)。
[0073] 如本文所用，"聚合條件"及其衍生詞，通常是指適合核苷酸聚合的條件。在典型的 實(shí)施方案中，這樣的核苷酸聚合是由聚合酶催化的。在一些實(shí)施方案中，聚合條件包括用于 引物延伸的條件，任選地以模板依賴性的形式，導(dǎo)致合成的核酸序列的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方 案中，所述聚合條件包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。典型地,所述聚合條件包括足以合成核酸 并且包括聚合酶和核苷酸的反應(yīng)混合物的使用。所述聚合條件可以包括用于在聚合酶的存 在下靶特異性引物與靶序列的退火和以模板依賴性的形式的引物的延伸的條件。在一些實(shí) 施方案中，聚合條件可以采用熱循環(huán)進(jìn)行。另外，聚合條件可以包括多個(gè)循環(huán)，其中重復(fù)兩 條核酸鏈的退火、延伸和分離步驟。典型地，所述聚合條件包括陽離子（如MgCl 2)。通常， 一個(gè)或多個(gè)核苷酸形成核酸鏈的聚合包括所述核苷酸被通過磷酸二酯鍵互相連接，但是， 替代的連接可存在于特定核苷酸類似物的背景中。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"核酸"是指天然核酸、人工核酸、其類似物或其組合，包括多核 苷酸和寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語"多核苷酸"和"寡核苷酸"在本文中互換使用并意味 著核苷酸的單鏈和雙鏈聚合物，包括但不限于由核苷酸間的磷酸二酯鍵（例如3'-5'和 2'_5'）、反向鍵（例如3'-3'和5'-5'）、支鏈結(jié)構(gòu)連接的2'-脫氧核糖核苷酸（核酸）和 核糖核苷酸（RNA)，或核酸類似物。多核苷酸具有相關(guān)聯(lián)的抗衡離子（counter ion)，如H+、 NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等。寡核苷酸可以完全由脫氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其 嵌合混合物組成。寡核苷酸可以由核堿基和糖類似物組成。多核苷酸大小典型地在從幾個(gè) 單體單元（例如5-40個(gè)）（當(dāng)它們在現(xiàn)有技術(shù)中被更普遍經(jīng)常稱為寡核苷酸）到幾千個(gè)單 體核苷酸單元（當(dāng)它們在現(xiàn)有技術(shù)中被更普遍稱為多核苷酸）的范圍內(nèi)；但是，對于本公開 內(nèi)容的目的來說，寡核苷酸和多核苷酸二者均可以是任何合適的長度。除非另外表示，否則 每當(dāng)表示寡核苷酸序列時(shí)，應(yīng)理解的是所述核苷酸是以從左到右5'到3'的順序，并且"A" 表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞苷，"G"表示脫氧鳥苷、"T"表示胸苷以及"U"表示脫氧尿 苷。寡核苷酸之所以被認(rèn)為具有"5'端"和"3'端"是因?yàn)閱魏塑账岬湫偷赝ㄟ^一個(gè)核苷 酸的5'磷酸或等價(jià)基團(tuán)被連接至它的相鄰核苷酸的3'羥基或等價(jià)基團(tuán)而反應(yīng)形成寡核苷 酸，任選地通過磷酸二酯鍵或其它合適的鍵。
[0075] 如本文所用，術(shù)語"切口平移"及其變體包含核酸鏈內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)切口或缺口沿 著所述核酸鏈向新位置的易位（translocation)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)雙鏈接頭被連接至 雙鏈擴(kuò)增的靶序列時(shí)可以形成切口。在一個(gè)例子中，所述引物可以包括在其5'端，能夠連 接至所述雙鏈擴(kuò)增的靶序列的磷酸基團(tuán)，留下在互補(bǔ)鏈中所述接頭和所述擴(kuò)增的靶序列之 間的切口。在一些實(shí)施方案中，切口平移導(dǎo)致所述切口向所述核酸鏈的3'端的移動(dòng)。在一 些實(shí)施方案中，移動(dòng)所述切口可以包括在所述接頭連接的擴(kuò)增的靶序列上進(jìn)行切口平移反 應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述切口平移反應(yīng)可以被偶聯(lián)5'到3'DNA聚合/降解反應(yīng)，或被 偶聯(lián)至5'到3'DNA聚合/鏈置換反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)所述切口可以包括在所述 切口位點(diǎn)進(jìn)行DNA鏈延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)所述切口可以包括在所述切口上 進(jìn)行單鏈外切酶反應(yīng)以形成所述接頭連接的擴(kuò)增的靶序列的單鏈部分和在所述接頭連接 的擴(kuò)增的靶序列的單鏈部分上進(jìn)行DNA鏈延伸反應(yīng)以形成新的位置。在一些實(shí)施方案中， 在連接位點(diǎn)相對的核酸鏈中形成切口。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"（"PCR"）是指K.B. Mullis的美國專利號 4, 683, 195和4, 683, 202 (其作為參考引入）的方法，其描述了用于在未經(jīng)克隆或純化的基 因組DNA混合物中提高感興趣的多核苷酸的片段的濃度的方法。用于擴(kuò)增所述感興趣的多 核苷酸的該過程包括向含有感興趣的所期望的多核苷酸的DNA混合物中引入大量過量的 兩種寡核苷酸引物，接著在DNA聚合酶存在下精確序列的熱循環(huán)。兩個(gè)引物與感興趣的雙 鏈多核苷酸的各自鏈互補(bǔ)。為了有效擴(kuò)增，所述混合物被變性，然后所述引物與感興趣的 多核苷酸分子內(nèi)的互補(bǔ)序列退火。退火之后，所述引物用聚合酶延伸以形成新的一對互補(bǔ) 鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可以被重復(fù)許多次（即，變性、退火和延伸組成一 個(gè)"循環(huán)（cycle)";可以有許多"循環(huán)"）以獲得感興趣的所期望的多核苷酸的高濃度的擴(kuò) 增片段。感興趣的所期望的多核苷酸的擴(kuò)增片段（擴(kuò)增子）的長度由引物相對于彼此的相 對位置確定，并因此，該長度是可控參數(shù)。憑借著重復(fù)該過程，所述方法被稱為"聚合酶鏈 式反應(yīng)"（下文中稱為"PCR"）。由于感興趣的所述多核苷酸的所期望的擴(kuò)增片段在混合物 中成為主要核酸序列（在濃度方面），它們被認(rèn)為是"PCR擴(kuò)增"。如本文所定義，包括多個(gè) 靶核酸分子的樣品內(nèi)的靶核酸分子通過PCR被擴(kuò)增。在上述方法的變形例中，所述靶核酸 分子可以采用多個(gè)不同的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在一些情況下，每個(gè)感興趣的靶核酸分子 一個(gè)或多個(gè)引物對，從而形成多重PCR反應(yīng)。采用多重PCR，能夠從樣品同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)感興 趣的核酸分子以形成擴(kuò)增的靶序列。還能夠通過幾種不同的方法（例如，用生物分析儀或 qPCR定量，用標(biāo)記的探針雜交；摻入生物素標(biāo)記的引物接著抗生物素蛋白-酶綴合檢測；向 所擴(kuò)增的靶序列摻入32P標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸，如dCTP或dATP)檢測所擴(kuò)增的靶序列。 用合適的引物組可以擴(kuò)增任何寡核苷酸序列，從而允許從基因組DNA、cDNA、福爾馬林固定 石蠟包埋DNA、細(xì)針活檢和各種其它來源擴(kuò)增靶核酸分子。特別是，通過如本文所公開的多 重PCR過程所創(chuàng)建的擴(kuò)增的靶序列，其自身是用于后續(xù)PCR擴(kuò)增或各種下游測定或操作的 有效底物。
[0077] 如本文所定義，"多重?cái)U(kuò)增"是指采用至少一個(gè)靶特異性引物在樣品內(nèi)兩個(gè)或更多 個(gè)靶序列的選擇性和非隨機(jī)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，多重?cái)U(kuò)增是這樣進(jìn)行的，使得一些或 所有的靶序列在單個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)被擴(kuò)增。給定多重?cái)U(kuò)增的"叢（Plexy) "或"叢（Plex) "通 常是指在該單個(gè)多重?cái)U(kuò)增過程中擴(kuò)增的不同靶特異性序列的數(shù)量。在一些實(shí)施方案中，所 述叢（plexy)可以是大約 12-叢（plex)、24-叢、48-叢、96-叢、100-叢、130-叢、192-叢、 384-叢、768-叢、1536-叢、3072-叢、6144-叢或更高。
[0078] 用于人身份識別（human identification)的SNP組。本文公開了單核苷酸多態(tài) 性（SNP)區(qū)域的組（panel)，其對于特異性識別人身份尤其有用，因?yàn)槊拷M（set)顯示出高 的平均雜合度和總的低群體變異性（R st)。采用用來識別人身份的這些組的任意一個(gè)提供 了針對個(gè)體識別的匹配概率而無需顯著依賴于其祖先。這些組可以提供同時(shí)常染色體、Y 染色體、X染色體和表型SNPs的覆蓋，特別是當(dāng)在高度多路復(fù)用下一代測序應(yīng)用（如Ion Torrent PGM?或 Ion Torrent Proton?(Life Technologies))中進(jìn)行分析時(shí)。如接下來 的章 節(jié)所述，多個(gè)引物可以被設(shè)計(jì)為證明引物對適于選擇性雜交到SNPs組中的每個(gè)SNP區(qū) 域，并摻入這些下一代測序儀工作流程所需要的設(shè)計(jì)特征。
[0079] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及用于避免或減少在核酸分子群體中一個(gè) 或多個(gè)靶核酸分子的選擇性擴(kuò)增過程中擴(kuò)增假體（例如引物二聚體）的形成的方法、組合 物、系統(tǒng)、設(shè)備和試劑盒。
[0080] 在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容通常涉及從核酸分子群體擴(kuò)增多個(gè)靶特異性序 列。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將一個(gè)或多個(gè)靶特異性引物對雜交至所述靶序列，延 伸所述引物對的第一引物，從所述核酸分子群體變性所延伸的第一引物產(chǎn)物，將所述延伸 的第一引物產(chǎn)物與所述引物對的第二引物雜交，延伸所述第二引物以形成雙鏈產(chǎn)物，以及 從所述雙鏈產(chǎn)物消化掉所述靶特異性引物對以產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增的靶序列。在一些實(shí)施方案 中，所述消化包括從所擴(kuò)增的靶序列的一個(gè)或多個(gè)所述靶特異性引物的部分消化。在一些 實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增的靶序列可以被連接至一個(gè)或多個(gè)接頭。在一些實(shí)施方案中，所述接 頭可以包括一個(gè)或多個(gè)DNA條形碼或標(biāo)簽序列。在一些實(shí)施方案中，一