一種基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和增殖的載體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術領域，設及一種基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和 增殖的載體及其應用，尤其是作用于奶山羊雄性生殖干細胞。
【背景技術】
[0002] 奶山羊是我國重要的經(jīng)濟動物，生產(chǎn)中發(fā)生的巨胎癥，致死率高和發(fā)育遲緩等疾 病嚴重阻礙了優(yōu)良動物品種的保持和優(yōu)化。而該些疾病很大程度上與精子發(fā)生和胚胎發(fā)育 異常相關。因此提高精子質(zhì)量和胚胎質(zhì)量，在減少疾病發(fā)生，促進優(yōu)良品種的遺傳與繁育等 技術難題都是家畜大動物的遺傳育種領域亟待解決的。哺乳動物精子發(fā)生過程中DNA甲基 化的建立是一個獨特的動態(tài)變化過程，適當?shù)腄NA甲基化對建立正確的表觀修飾模式，維 持胚胎后期正常發(fā)育具有重要作用。
[0003] 小鼠、人等胚胎生殖細胞和雄性生殖干細胞的培養(yǎng)體系已被初步建立，并了解 了 其基本的生物學特性（Kubota H，Avarbock MR, Brinster 化.2004. Grow化 factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Rroc Natl Acad Sci USA. 101(47):16489-16494 ;0atley JM，Avarbock MR, Telaranta AI,Fearon DT,Brinster 民L. 2006.Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proc Natl Acad Sci USA. 103 巧巧：9524_9529)， 并分別從成年小鼠睪丸組織分離得到多能性的雄性生殖干細胞。后期研究發(fā)現(xiàn)CD49f、 CD90(Thyl)、C-kit (CD117)、GFRal等可作為雄性生殖干細胞的特異性標記，并已用于純化 小鼠和人的雄性生殖干細胞。體外培養(yǎng)為研究mGSCs功能調(diào)控的分子機制及細胞信號通 路提供了新的方法。目前，雖然體外培養(yǎng)和擴增多能性ES細胞已經(jīng)日趨常規(guī)化，但成體 組織干細胞（包括mGSCs)體外培養(yǎng)技術的建立卻依然較困難。盡管在過去的10年間， 已報道了許多關于小鼠和大鼠mGSCs體外培養(yǎng)的進展化anatsu-Shinohara M，Lee J，et al..2008.Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biology Of Reproduction. 78 (4):681-687 ；0atley JM,Avarbock MR, Telaranta AI,Fearon DT, Brinster 民L. 2006. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proc Natl Acad Sci USA. 103(25) :9524_9529)。目前， 嗎齒類動物的mGSCs可臥在體外培養(yǎng)很長的時間，細胞的增殖也很顯著。有報道認為 mGSCs具有轉(zhuǎn)化為多能性干細胞的潛能化anatsu-Shinohara M, Lee J，et al.. 2008. Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biology Of 民邱roduction. 78 (4) :681-687)。這一特性使得mGSCs具有巨大的優(yōu)勢，然而其具體的遺 傳、表觀遺傳及其發(fā)育潛能等機制還需要進一步研究。
[0004] Tet (Ten-eleven translocation)蛋白家族在胚胎干細胞巧SCs)中高表達，Tetl 可臥結合到基因CG富含區(qū)的CXXC區(qū)域，優(yōu)先結合有轉(zhuǎn)錄功能的基因和轉(zhuǎn)錄抑制的基因的 啟動子區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS)。Tetl的靴基因在個體發(fā)育、分化和神經(jīng)發(fā)生過程中參 與多個細胞通路。Tetl蛋白在表觀修飾的過程中并不參與全基因組范圍內(nèi)的廣譜去甲基 化，而是在primordial germ cells (PGCs)發(fā)育進程中位點特異性的進行適當?shù)挠∮浤ǔ?(Clark et al.，2013 ;Vincent et al.，2013)，W確保后續(xù)兩性生殖細胞的正常發(fā)育。在小 鼠精子發(fā)生過程中，Tetl在二倍體細胞中比單倍體表達量高，提示Tetl表達的動態(tài)變化參 與精子發(fā)生的表觀修飾調(diào)控進程（Gan et al. , 2013)。
[0005] Tetl能特異性抹除基因組印記值awlaty et al. , 2013)，成功遷徙的精原干細胞 在成體精子發(fā)生的后續(xù)生命周期中都通過甲基化動態(tài)變化維持自我更新與分化（Gan et al.，2013)。目前，Tetl缺失的ESCs和裸鼠都已獲得，研究發(fā)現(xiàn)Tetl缺失的ESCs仍然保 持全能性狀態(tài)，Tetl缺失的裸鼠健康并有繁殖能力，但存在出生重比較低的缺陷，而且中性 粒細胞和種內(nèi)雜交同胎生仔數(shù)相對要少，說明Tetl在胚胎發(fā)育和精子發(fā)生過程中發(fā)揮了 作用值awlaty et al.，2011)。但是，Tetl異常高表達會引起生殖細胞癌變，證明Tetl的 主動去甲基化在細胞癌化的惡意增殖過程中發(fā)揮功能（Nettersheim et al.，2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和增殖 的載體及其應用，通過構建mTetl慢病毒表達載體并轉(zhuǎn)染到奶山羊精原干細胞，促進奶山 羊精原干細胞的自我更新能力及細胞增殖能力。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)：
[000引一種基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和增殖的載體，該載體包裹于慢病毒 之中，載體上攜帶有mTetl基因。
[0009] 所述的載體為慢病毒載體，所述的mTetl基因的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
[0010] 所述的慢病毒載體上還設有抗生素篩選基因和標記基因。
[0011] 所述的載體為慢病毒載體pC畑-mTetl,是將mTetl基因克隆到基礎載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GreenPuro中的多克隆位點而得到。
[0012] 一種基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和增殖的重組慢病毒，該重組慢病毒 是由慢病毒載體pCDH-mTetl與輔助質(zhì)粒PAX和VSVG轉(zhuǎn)染293T細胞，經(jīng)解育后獲取的； [001引所述的慢病毒載體pCDH-mTetl，是將mTetl基因克隆到基礎載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GreenPuro中的多克隆位點而得到。
[0014] 所述的基于去甲基化促進生殖干細胞自我更新和增殖的載體在促進奶山羊雄性 生殖干細胞的自我更新、維持多能性和增殖中的應用。
[0015] 所述的載體通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染奶山羊雄性生殖干細胞，上調(diào)與自我更新和多能 性相關基因的表達，促進奶山羊雄性生殖干細胞進行細胞增殖的S期。
[0016] 所述的自我更新和多能性相關基因包括0ct4、Plzf和和G化al。
[0017] 一種促進奶山羊雄性生殖干細胞的自我更新和增殖的方法，包括W下操作：
[00化]1)克隆如SE化ID. NO. 1所示的mTetl基因，并將其克隆到慢病毒表達載體中構建 mTetl慢病毒表達載體；
[0019] 2)將待轉(zhuǎn)染的293T細胞加入到DMEM培養(yǎng)液中；將構建的mTetl慢病毒表達載體 與輔助質(zhì)粒PAX和VSVG在化ti-MEM中混勻，然后加到轉(zhuǎn)染試劑化rboFect中吹打混勻，室 溫解育后得到病毒感染液，再加入到DMEM培養(yǎng)液中，進行細胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染1化后更換新鮮的 病毒感染液繼續(xù)轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染3化后收取包含重組了 mTetl的慢病毒的毒液；
[0020] 3)將收取的毒