液和新鮮DMEM-F12培養(yǎng)液混合后加入接種有奶山羊雄性生殖干細(xì) 胞的培養(yǎng)板中，1化后轉(zhuǎn)換為含血清的正常DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，4她后加入抗生 素進(jìn)行抗性篩選；
[0021] 4)mTetl陽性表達(dá)的奶山羊精原干細(xì)胞，其自我更新能力增高，細(xì)胞增殖加快。 [002引所述的mTetl慢病毒表達(dá)載體與PAX和VSVG的質(zhì)量比例為4:3:2。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0024] 本發(fā)明提供的基于去甲基化促進(jìn)生殖干細(xì)胞自我更新和增殖的載體，通過將 mTetl基因通過多克隆位點(diǎn)克隆到慢病毒表達(dá)載體上，通過慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染奶山羊雄性 生殖干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)mTetl在奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的整合與表達(dá)，該樣的整合使得mTetl基 因發(fā)揮其去甲基化作用，能夠促進(jìn)奶山羊精原干細(xì)胞的自我更新能力及細(xì)胞增殖能力。
[0025] 本發(fā)明提供的基于去甲基化促進(jìn)生殖干細(xì)胞自我更新和增殖的載體，通過慢病毒 表達(dá)之后使得mTetl基因整合到奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的基因組。對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)的陽性細(xì)胞進(jìn)行 培養(yǎng)，表現(xiàn)出縱禍狀成簇生長，細(xì)胞形態(tài)學(xué)良好，流式分析細(xì)胞增殖周期，發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞數(shù) 量增加，表明增殖能力增強(qiáng)，而且轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)雄性生殖干細(xì)胞相關(guān)基因任LZF和紅ral) 和自我更新相關(guān)基因（0ct4)表達(dá)上調(diào)，分化相關(guān)基因（Scp3)表達(dá)下調(diào)。
[0026] 慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基 因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞 中。因此，在本發(fā)明中選用作用穩(wěn)定的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)mTetl基因，表達(dá)效果良好。
【附圖說明】
[0027] 圖1慢病毒表達(dá)載體pCDH-mTetl的質(zhì)粒圖譜；
[002引 圖2BamHI單酶切（Marker右側(cè)）、BamHI和Notl雙酶切（Marker左側(cè)）鑒定陽性 重組質(zhì)粒pCDH-mTetl ;
[0029] 圖3巧光顯微鏡觀察病毒包裝過程中pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)的293T細(xì)胞及報(bào) 告基因GFP的表達(dá)；
[0030] 圖4巧光顯微鏡觀察pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞及報(bào)告 基因GFP的表達(dá)；
[0031] 圖5流式細(xì)胞儀檢測pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的報(bào)告 基因GFP表達(dá)的陽性率；
[0032] 圖6對(duì)pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞cDNA的mTetl基因擴(kuò) 增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；
[0033] 圖7對(duì)pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)記基因的相 對(duì)表達(dá)量檢測結(jié)果；
[0034] 圖8 W pC畑空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞為對(duì)照，用流式細(xì)胞儀檢測對(duì)pC畑-mTetl載 體陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明首先構(gòu)建含有mTetl和綠色巧光蛋白佑FP)基因的慢病毒表達(dá)載體 pCDH-mTetl，其次用慢病毒載體法將慢病毒表達(dá)載體pCDH-mTetl導(dǎo)入奶山羊雄性生殖干 細(xì)胞，巧光顯微鏡觀察標(biāo)記基因GFP的表達(dá)情況，并經(jīng)嚷嶺霉素篩選獲得陽性細(xì)胞，進(jìn)行 PCR鑒定，證實(shí)目的基因mTetl整合到奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的基因組。
[0036] 具體所設(shè)及的主要試劑如下：嚷嶺霉素、DMEM、DMEM-F12培養(yǎng)基均購自美 國GIBCO (Invitrogen)公司，邸TA和Trypsin購自美國Sigma公司，胎牛血清為美國 HY化0肥(HTCL0肥）公司，細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿為丹麥Nunclon公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒 購自天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和化rboFect轉(zhuǎn)染試劑均購自Thermo公司。DNA聚合酶購自 全式金公司。
[0037] 下面結(jié)合附圖和實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明解釋的而不 是限定。
[003引 1、慢病毒表達(dá)載體pC畑-mTetl的構(gòu)建
[0039] a、目的基因mTetl的克隆
[0040] 根據(jù)GeneID:GU079948所公布的mTetlmRNA序列設(shè)計(jì)引物P1和P2, W小鼠ES細(xì) 胞的cDNA為模板用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：
[0041] 前向引物 P1: ATGTCTCGGTCCCGCCCCGCAAAGCCTTC 29
[0042] 后向引物 P2: TTAGAACCAACGATTGTAGGGTCCCG 26
[0043] 25uL 的 PCR 反應(yīng)體系為；5XFly Buffer ;5uL，dNTPs(2. 5mmol/L) ;2uL， PU5mol/L) ; 1 y L，P2 巧mol/L) ; 1 y L，F(xiàn)as巧fu 聚合酶巧U/ y L) ;0. 15 y L，模板；1. 5 y L， Mg"巧Ommol/L) ; 1 y L，加超純水至 25 y L。
[0044] PCR 反應(yīng)條件為；94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 6min， 30個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min ; a
[0045] PCR產(chǎn)物與pMD-lST Vector 4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli D冊a，通過 曰-互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)Notl酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pCDH-mTetl并送交上 海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。mTetl基因測序結(jié)果如SE化ID. NO. 1所示，與公布的 mTetlmRNA序列（GeneID:GU079948)同源性為99. 7%，因此，所克隆的基因?yàn)閙Tetl基因。
[0046] b、pCDH-mTetl 的載體結(jié)構(gòu)
[0047] 如圖1所示，本發(fā)明具體W pCDH-CMV-MCS-EFl-Green化ro慢病毒基礎(chǔ)載體和 pMD-18T-mTetl載體構(gòu)建包含目的基因mTetl的慢病毒表達(dá)載體pCDH-mTetl。
[0048] pCDH-mTetl載體的構(gòu)建如下；
[0049] 將SE化ID. NO. 1所示的mTetl片段TA克隆到PMD-18T載體（購自大連寶生物公 司）上，獲得的載體命名為pMD-18T-mTetl。
[0化日]pCDH-CMV-MCS-EFl-Green化ro載體包含嚷嶺霉素抗性篩選基因化ro和帶 有EF1啟動(dòng)子的標(biāo)記基因GFP ;標(biāo)記基因GFP可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高表達(dá)并產(chǎn)生巧光； pCDH-CMV-MCS-EFl-Green化ro載體商購就可W獲得。
[005U 用BamHI和Notl雙酶切載體pCDH-CMV-MCS-EFl-GreenPuro,膠回收片段，按照重 組載體中的酶切位點(diǎn)BamHI和NotI設(shè)計(jì)引物，W pMD-18T-mTet 1為模板用引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，其中，引物對(duì)為：
[0052] 前向引物 P3:GGATCCATGTCTCGGTCCCGCC 22
[0053] 后向引物 P4: AAGCGGCCGCTTAGAACCAACGATTGTAGGG 31
[0化4] 按照a步驟中的PCR體系，膠回收純化PCR產(chǎn)物，用BamHI和Not I雙酶切mTet 1片 段，膠回收，用T4DNA連接酶4°C連接過夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli D冊a，經(jīng)BamHI單酶 切、BamHI和Notl雙酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒，如圖2所示，其中，泳道2Marker，為化15000， 大小分別代表 250bp，lOOObp，2500bp，5000bp，7500bp，lOOOObp 和 15000bp ;泳道 3 為 BamHI 單酶切鑒定，可W看到一條約為13479的條帶；泳道1為BamHI和Notl雙酶切鑒定，可W 看到7377bp和6120bp的兩條條帶，說明mTetl通過BamHI和Notl酶切位點(diǎn)克隆到了載體 pCDH-CMV-MCS-EF