l-GreenPuro上，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pCDH-mTetl (檢測(cè)圖中標(biāo)示為 mGSC-mTetl)。
[0化5] 由于質(zhì)粒在大腸桿菌中增殖，用普通的質(zhì)粒提取方法容易將細(xì)菌內(nèi)毒素帶到終 產(chǎn)物中，細(xì)菌內(nèi)毒素的存在會(huì)影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生長，所W本研究使用了去內(nèi)毒素 的質(zhì)粒提取試劑盒，W減少內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的負(fù)面影響。用天根公司的去內(nèi)毒素的質(zhì)粒 純化試劑盒提取質(zhì)粒后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒的濃度為 48化g/1，0D260/280為1. 91，說明質(zhì)粒較純，可用于轉(zhuǎn)染。
[0056] 本發(fā)明通過多克隆位點(diǎn)BamHI和Notl將目的基因mTetl插入到 pCDH-CMV-MCS-EFl-Green化ro上的多克隆位點(diǎn)，使mTet 1基因在轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞中持續(xù)表 達(dá)。
[0化7] 2、pCDH-mTetl慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞及細(xì)胞篩選
[0化引 c、293T細(xì)胞和奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0化9] 從液氮中分別取一管293T細(xì)胞和奶山羊雄性生殖干細(xì)胞于38°C解凍，分別加入 0. 8ml的DMEM和DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液離屯、，棄上清，加細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，取4ml細(xì)胞懸浮液 接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，置于C〇2培養(yǎng)箱中38. 5°C條件下培養(yǎng)。
[0060] 待2931'細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用無〔3"、1護(hù)的？85沖洗細(xì)胞，加入 膜酶與邸TA混合消化液，消化細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì)胞回縮、變圓、 細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí)，用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打后，離屯、 收集，懸浮，按1 : 3的比例接種于多聚賴氨酸處理皿底的60mm皿中，放入C〇2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80%匯合用于病毒包裝。
[0061] 待奶山羊雄性生殖干細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用無Ca2\ Mg"的PBS沖 洗細(xì)胞，加入膜酶與邸TA混合消化液，消化細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì) 胞回縮、變圓、細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí)，用含10%胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用移 液器吹打后，離屯、收集，懸浮，按1 : 3的比例接種于12孔板，放入C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。奶 山羊雄性生殖干細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0062] 本發(fā)明W嚷嶺霉素作為篩選藥物，由于載體pCDH-CMV-MCS-EFl-GreenPuro的骨 架上含有嚷嶺霉素抗性基因化ro,外源基因mTetl得到表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞能夠 在含有一定濃度嚷嶺霉素的培養(yǎng)液中存活下來，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常細(xì)胞會(huì)在該濃度下死亡， 因此，需要確定正常細(xì)胞嚷嶺霉素的最小致死濃度來作為篩選濃度。
[0063] 嚷嶺霉素最小致死濃度的測(cè)定；在奶山羊雄性生殖干細(xì)胞培養(yǎng)液值MEM-F12細(xì)胞 培養(yǎng)液）中分別加入濃度梯度的嚷嶺霉素篩選1周，測(cè)定正常細(xì)胞的嚷嶺霉素最小致死濃 度。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中嚷嶺霉素的濃度〉900g/ml時(shí)，在顯微鏡下可見細(xì)胞全部死亡，所W嚷 嶺霉素的最小致死濃度為900g/ml。
[0064] e、pCDH-mTetl慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞
[0065] 轉(zhuǎn)基因的方法有很多種，包括電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、病毒載體法、受體 介導(dǎo)法等。本發(fā)明具體采用病毒載體法，用pCDH-mTetl慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊雄性生 殖干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑化rboFect是一種獨(dú)特的陽離子多聚物水溶液，其與強(qiáng)效緩沖液配合 使用可高效地將蛋白、抗體和多膚導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中。無論培養(yǎng)基中是否含有血清，該試劑均能 轉(zhuǎn)染蛋白。用化rboFect進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移與其它方法相比，操作簡便、重復(fù)性好、不受DNA大 小限制、毒性小，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。具體為：
[0066] 包毒前一天，將293T細(xì)胞W 2X106接種于60mm皿中，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞達(dá)到 70-80%匯合。包裝病毒前換預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)液，分別將8g pCDH-mTetl與輔助質(zhì)粒 PAX和VSVG(CLONTECH)按照4:3:2的質(zhì)量比例加入100 y 1 Opti-MEM中進(jìn)行混勻，然后加 入18 y 1的化rboFect吹打混勻，室溫解育20min后，緩慢將其加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中；1化后 換新鮮的病毒包裝液；pCDH-mTetl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞2化后，在巧光顯微鏡下可W觀察到綠色巧光， 如圖3所示，轉(zhuǎn)基因的293T細(xì)胞發(fā)出綠色巧光，3化后收取包含重組了 mTetl的慢病毒的毒 液，于-80°C冰箱保存待用。
[0067] 接種前一天，將奶山羊雄性生殖干細(xì)胞W 1X105接種于12孔板中，培養(yǎng)過夜使細(xì) 胞達(dá)到70-80%匯合。對(duì)于每孔細(xì)胞，分別將恢復(fù)室溫的毒液和新鮮DMEM-F12培養(yǎng)液按照 1:1的比例加入每孔，1化后轉(zhuǎn)換為含血清的正常DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，4她后加 入嚷嶺霉素至終濃度900 y g/ml。
[0068] f、pC畑-mTetl載體陽性表達(dá)的細(xì)胞篩選
[0069] pCDH-mTetl載體轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞2化后，在巧光顯微鏡下觀察報(bào)告基 因GFP的表達(dá)情況，并在4她后在含血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液中添加900 y g/ml的最小 致死濃度的嚷嶺霉素篩選；W未轉(zhuǎn)染pCDH-mTetl的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞為陰性對(duì)照，其 細(xì)胞培養(yǎng)液加有同樣濃度的嚷嶺霉素巧00 y g/ml)。
[0070] pCDH-mTetl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞2化后，在巧光顯微鏡下可W看到綠色巧光，如圖4所示，轉(zhuǎn) 基因的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞發(fā)出綠色巧光，說明pCDH-mTetl已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞且陽性表達(dá)； pCDH-mTetl轉(zhuǎn)染細(xì)胞7d后，對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，將包含pCDH-mTetl轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞組 的嚷嶺霉素濃度減半持續(xù)篩選直到細(xì)胞長滿皿底，可見到陽性細(xì)胞形成島蝸狀細(xì)胞群，在 巧光顯微鏡下仍然可W看到綠色巧光；然后消化細(xì)胞，用不加嚷嶺霉素的正常培養(yǎng)液擴(kuò)大 培養(yǎng)。
[0071] 本發(fā)明篩選的陽性細(xì)胞都是穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)pCDH-mTetl的細(xì)胞，目的基因mTetl整合 到細(xì)胞的基因組上，而不是游離于基因組之外；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中，質(zhì)粒pCDH-mTetl上 攜帶的基因會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組上，整合的位置是隨機(jī)的；通過嚷嶺霉素篩選7天， 再半劑量持續(xù)篩選來達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的，表現(xiàn)為報(bào)告基因在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的陽性細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表 達(dá)，因此，篩選的陽性細(xì)胞持續(xù)發(fā)出綠色巧光并呈現(xiàn)嚷嶺霉素抗性，結(jié)果如圖4所示。采用 流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)陽性細(xì)胞GFP表達(dá)比例，結(jié)果如圖5所示，陽性率高于93%，證明細(xì)胞 的純度很高，可W用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0072] g、pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)細(xì)胞的PCR鑒定
[0073] 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的pCDH-mTetl陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA， W cDNA為模板，PCR鑒定mTetl基因是否整合到細(xì)胞基因組中，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染的正常 奶山羊雄性生殖干細(xì)胞，PCR鑒定所用引物對(duì)為PI和P2 ;
[0074] PCR 反應(yīng)條件為；94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 6min， 30個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min ;回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果 如圖6所示，其中，泳道1為DNA Marker化15000,泳道2為pCDH-mTetl轉(zhuǎn)導(dǎo)的奶山羊雄性 生殖干細(xì)胞，明顯可W看到一條6120bp左右的條帶，說明目的基因mTetl整合到了宿主細(xì) 胞奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的基因組。
[0075] 3、pCDH-mTetl轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的功能檢測(cè)
[0076] h、pCDH-mTetl載體陽性表達(dá)細(xì)胞的基因表達(dá)鑒定
[0077] 取擴(kuò)大培養(yǎng)后的pCDH-mTetl陽性表達(dá)的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，W cDNA為模板，q-RT-PCR鑒定mTetl超表達(dá)后細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)變化，對(duì)照組為未 轉(zhuǎn)染的正常奶山羊雄性生殖