用于檢測(cè)自身免疫性疾病的診斷方法和相關(guān)主題的制作方法
【專利說明】用于檢測(cè)自身免疫性疾病的診斷方法和相關(guān)主題 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及新鑒定的自身免疫性疾病的診斷和治療，提供包含衍生自新的細(xì)胞表 面自身抗原的至少一個(gè)表位的多肽或蛋白以及用于檢測(cè)和治療所述自身免疫性疾病的相 關(guān)裝置（means)和方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 記憶、行為、認(rèn)知和思維過程可以被自身抗體改變的這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)改變了之前被 認(rèn)為是特發(fā)性的（idiopathic)神經(jīng)精神疾病的診斷和治療方法（approach)。從2007年以 來(lái)，已經(jīng)鑒定了七種這樣的抗體（抗匪0六1?、410^1?、6484(8)、1^11工38口12、6171?和11161111?5)， 均靶向細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)參與突觸傳遞、可塑性或神經(jīng)興奮性并與盡管嚴(yán)重但 通常對(duì)免疫治療作出應(yīng)答的綜合征有關(guān)。 1患者可昏迷數(shù)月，具有怪異的行為、異常的動(dòng)作 或頑固性癲癇并在免疫治療和擴(kuò)展的護(hù)理支持下仍然恢復(fù)。2考慮到直到最近這些疾病是 未知的，一些疾病相對(duì)高的頻率已經(jīng)是令人驚訝的。例如，在專注于腦炎的診斷和流行病學(xué) 的中心（加利福尼亞腦炎項(xiàng)目）里，抗NMDAR腦炎的頻率超過了任何個(gè)體病毒性腦炎的頻 率。3由于這些原因，在未知病因的腦炎（經(jīng)常發(fā)生的情況）的背景下發(fā)展成快速進(jìn)展性神 經(jīng)精神癥狀的患者中，類似的免疫機(jī)制被越來(lái)越多地予以考慮。目前大約70%的不明病因 的腦炎在針對(duì)感染性病因的廣泛評(píng)估之后仍未得到診斷。 4在這樣的情形下，針對(duì)神經(jīng)元細(xì) 胞表面抗原的自身抗體的鑒定將管理轉(zhuǎn)向了免疫治療的使用，并且可以在其它方式被認(rèn)為 是徒勞的情況下擴(kuò)展重癥監(jiān)護(hù)支持。
[0004] 鑒于上述情況，本發(fā)明的潛在問題在于提供分別用于之前未鑒定的自身免疫性腦 炎或不明病因的腦炎的診斷和治療的裝置。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 該問題由本申請(qǐng)權(quán)利要求的方案得到解決，特別是通過提供包含衍生自DPPX(用 于檢測(cè)和治療自身免疫性疾?。ㄌ貏e是腦炎）的新的自身抗原）的至少一個(gè)表位的多肽或 蛋白質(zhì)，編碼這樣的多肽的核酸或載體，包含這樣的載體的細(xì)胞，涉及這樣的多肽的體外診 斷方法和檢測(cè)試劑盒，包含這樣的多肽的藥物組合物，涂敷有這樣的多肽或藥物組合物的 醫(yī)療設(shè)備以及用于治療受試者中自身免疫性疾?。ㄌ貏e是腦炎）的方法。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于這樣的事實(shí)，病因不明腦炎的診斷能夠分別鑒定所述疾病 為自身免疫性腦炎，區(qū)分其它（非自身免疫性）形式的腦炎或其他疾病或相關(guān)的癥狀，并從 而給患者的具體治療提供例如免疫抑制劑。
[0008] 附圖概述
[0009] 圖1顯示DPPX的免疫沉淀；
[0010] 圖2顯示腸肌叢中DPPX的表達(dá)；
[0011] 圖3顯示采用基于細(xì)胞的測(cè)定分析DPPX抗體；
[0012] 圖4顯示采用DPPX無(wú)效突變體和野生型小鼠的大腦對(duì)比患者的血清反應(yīng)性；
[0013] 圖5顯示用患者的血清免疫染色的大鼠大腦；
[0014] 圖6顯示采用表達(dá)缺失了DPPX細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的突變體（DPPXed-myc)的基于細(xì)胞 的測(cè)定分析患者的抗體；以及
[0015] 圖7顯示采用表達(dá)Kv4. 2的基于細(xì)胞的測(cè)定分析患者的抗體。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，"多肽"應(yīng)理解為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)或更多個(gè) 氨基酸的聚合物，其可以包括標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。本文互換使用術(shù)語(yǔ)多肽、肽和 蛋白質(zhì)。
[0018] 對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"自身免疫性疾病"涉及與抗DPPX抗體的出現(xiàn)有關(guān)的疾病。如本 文所報(bào)道的，具有這樣的自身免疫性疾病的患者患有例如包括癲癇、認(rèn)知功能障礙、幻覺、 精神病癥狀、情緒激動(dòng)、神志不清、靜止性震顫和肌陣攣的癥狀。這些癥狀的大部分與神經(jīng) 疾病有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，自身免疫性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫 性疾病。此外，本文所列的癥狀至少部分與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明 的另一個(gè)實(shí)施方案，所述自身免疫性疾病是自身免疫性腦炎。更進(jìn)一步地，一組特定的癥狀 (如震顫）也可以是由外周神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷（例如由影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自身免疫性疾?。?引起的。因此，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述自身免疫性疾病是外周神經(jīng)系統(tǒng)的 自身免疫性疾病。另外，在患有本文所述的疾病的患者中觀察到嚴(yán)重的腹瀉、便秘和體重減 輕，表明其它組織（如消化道的組織）也可以受這樣的自身免疫性疾病的影響。因此，根據(jù) 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述自身免疫性疾病是自主神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病。本文互 換使用術(shù)語(yǔ)病癥（disorder)和疾?。╠isease)。
[0019] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"表位"應(yīng)理解為能夠被抗體特異性識(shí)別（即結(jié)合）的多肽的 一部分。所述表位可以是構(gòu)象表位（由多肽的氨基酸序列的不連續(xù)部分組成）或線性表位 (由多肽的氨基酸序列的連續(xù)部分組成）。
[0020] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對(duì)于表位，術(shù)語(yǔ)"衍生的"涉及由多肽或蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸 序列的不連續(xù)或連續(xù)部分形成的表位。本領(lǐng)域已知的是，表位中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸可 以被取代，例如通過基本上不改變抗體結(jié)合強(qiáng)度或特異性的保守氨基酸置換（例如谷氨酸 至天冬氨酸E-D，谷氨酰胺至天冬酰胺Q-N，苯丙氨酸至酪氨酸F-Y，亮氨酸至異亮氨 酸L-I)。因此，術(shù)語(yǔ)"衍生的"還涉及這樣的表位：當(dāng)與具有原始氨基酸序列的表位相比， 盡管在氨基酸序列上具有差異，所述表位表現(xiàn)出不變的或基本上不變的抗體結(jié)合強(qiáng)度或特 異性。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，"核酸"涉及DNA或RNA聚合物，還包括其化學(xué)衍生物或合成類似物 (如肽核酸或嗎啉代核酸）。本領(lǐng)域已知的是，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，核酸編碼的某些變 化不會(huì)導(dǎo)致其所編碼的肽序列的變化。因此，術(shù)語(yǔ)"核酸"還涵蓋編碼相同肽序列、與原始 核酸序列在序列上存在不同的核酸序列。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的"載體"應(yīng)理解為包括插入物（例如編碼所需蛋白質(zhì)的基因或核酸 序列）和其它特征（如載體復(fù)制、所述插入物的表達(dá)、承載載體的宿主細(xì)胞的陽(yáng)性選擇或標(biāo) 記蛋白的表達(dá)所需的序列）的環(huán)狀或線性核酸序列。這樣的載體和序列是本領(lǐng)域廣泛已知 的。
[0023] 本發(fā)明范圍內(nèi)的"細(xì)胞"是能夠被載體轉(zhuǎn)化的任何原核或真核宿主細(xì)胞。例如，細(xì) 胞可以是細(xì)菌細(xì)胞（如大腸桿菌細(xì)胞）或真核細(xì)胞（如永生化的人培養(yǎng)細(xì)胞）。永生化的 人培養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)例子是J1EK293細(xì)胞。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"DPPX"涉及二肽基肽酶樣蛋白-6 (DPP6或DPPX)，KV4. 2鉀通道的細(xì)胞表面 輔助亞基。DPPX的同義詞包括二肽基氨肽酶相關(guān)蛋白、二肽基肽酶6、二肽基肽酶IV樣蛋 白和二肽基肽酶VI。
[0025] DPPX是高度保守的，使得即使是來(lái)自與人類關(guān)系較遠(yuǎn)的物種的DPPX也適合于引 發(fā)與人抗DPPX抗體的特異性結(jié)合。這也適用于DPPX蛋白的所有人同種型。此外，已知例如 線性MHCI類表位長(zhǎng)度為大約8至11個(gè)氨基酸。因此，在DPPX同系物中，在各自物種和人 類之間保守的、長(zhǎng)度在8至11個(gè)氨基酸的區(qū)域原則上已足以引發(fā)與人抗DPPX抗體的特異 性結(jié)合。在這方面，構(gòu)成構(gòu)象表位的保守序列可能甚至更短。因此，對(duì)于本發(fā)明，"DPPX"涉 及源自真核生物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選智人（homosapiens)或大鼠（rattusnorvegicus) 的DPPX蛋白的任何已知同種型。
[0026] 此外，與人抗DPPX抗體的特異性結(jié)合也可被DPPX的同系物（如DPPX天然存在的 同系物）引發(fā)。還包括DPPX非天然存在的同系物，例如，如通過單個(gè)或多個(gè)氨基酸或甚至 蛋白質(zhì)基序或結(jié)構(gòu)域的缺失或交換衍生自DPPX天然存在的同系物的同系物。因此，對(duì)于本 發(fā)明，"DPPX"還涉及DPPX天然和非天然存在的同系物。
[0027] 我們?cè)诒疚闹袌?bào)道4位患有新型自身免疫性疾病的患者，特征在于與抗 DPPX(KV4. 2鉀通道的細(xì)胞表面輔助亞基）抗體有關(guān)的認(rèn)知功能障礙、情緒激動(dòng)、幻覺、神志 不清、靜止性震顫和肌陣攣的亞急性發(fā)展。在三位患者中，嚴(yán)重腹瀉和體重減輕先于神經(jīng)學(xué) 癥狀出現(xiàn)或與其重疊，其程度達(dá)到兩位患者進(jìn)行了廣泛的內(nèi)窺鏡活檢而沒有得到明確診斷 的地步。腦脊液（CSF)細(xì)胞增多、增加的IgG指數(shù)或寡克隆帶和針對(duì)密集或持久的免疫治 療的神經(jīng)學(xué)應(yīng)答的存在給該病的自身免疫性病因提供支持。采用患者的抗體，三組實(shí)驗(yàn)確 立了DPPX作為主要自身抗原：從分離的大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物中免疫沉淀DPPX;基于細(xì) 胞的測(cè)定中DPPX的免疫染色和野生型和DPPX無(wú)效小鼠的對(duì)比大腦免疫染色，顯示出患者 抗體與DPPX無(wú)效小鼠大腦的反應(yīng)性的消除，并在一位患者中顯示出針對(duì)未知抗原的額外 的抗體。
[0028]DPPX具有通過重構(gòu)通道門控"上調(diào)（tuningup) "Kv4. 2通道的關(guān)鍵作用。5這種 類型的鉀通道屬于哺乳動(dòng)物ShalK+通道家族6(其具有與ShakerK+(Kvl)家族相比不同 的性質(zhì)），之前被認(rèn)為是抗體相關(guān)邊緣性腦炎、神經(jīng)性肌強(qiáng)直或莫旺氏（Morvan's)綜合征 (主要自身抗原是LGI1和Caspr2)的靶標(biāo)。7'8Kv4. 2通道在膜電位的亞閾值范圍內(nèi)工作。 5這種細(xì)胞體-樹突亞閾值A(chǔ)型K+電流（ISA)是決定細(xì)胞體-樹突信號(hào)整合的電壓門控離 子流的集合（ensemble)的關(guān)鍵組成部分。9在許多神經(jīng)元中，始于軸丘（axonhillock)的 動(dòng)作電位不但沿軸下傳而且回傳入樹突。在樹突樹中，這些動(dòng)作電位充當(dāng)報(bào)告神經(jīng)元輸出 狀態(tài)的信號(hào)。樹突中的瞬時(shí)亞閾值、電流減弱動(dòng)作電位的這種回傳。在靜息條件下，ISA 關(guān)閉該動(dòng)作電位，因?yàn)樗噲D傳入樹突樹的遠(yuǎn)端區(qū)域。然而，在某個(gè)時(shí)間窗口內(nèi)興奮性突觸 輸入與體細(xì)胞動(dòng)作電位配對(duì)時(shí)，在遠(yuǎn)端樹突中隨之而來(lái)的亞閾值去極化滅活I(lǐng)SA，并且回傳 動(dòng)作電位的衰減實(shí)質(zhì)上被降低了。6據(jù)信，這種相互作用提供了一致性檢測(cè)機(jī)制，其在樹突 Ca++信號(hào)傳導(dǎo)、信號(hào)整合和突觸可塑性中起著重要作用。5'6' 9
[0029]Kv4通道的功能依賴于兩個(gè)輔助亞基，即細(xì)胞內(nèi)Kv通道相互作用蛋白（KChIPs)，1Q 和細(xì)胞外DPPX(主要表達(dá)于海馬錐體神經(jīng)元和小腦）或DPP10 (具有不同的大腦表達(dá)譜并 且還存在于胰腺）。n'12DPPX由短的細(xì)胞質(zhì)N末端、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和大的細(xì)胞外C末端組 成。依賴于細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度，已經(jīng)鑒定了兩個(gè)成熟形式，DPPX-S和DPPX-L。13'14與抗細(xì) 胞外表位抗體的存在一致的是，我們的4位患者的血清和CSF同等識(shí)別DPPX-S和DPPX-L， 但是兩位患者具有抗細(xì)胞外C末端被缺失的突變體構(gòu)建