bur軟件（Thermo Scientific，Waltham，MA)獲得原始數(shù)據(jù)。米用Mascot(MatrixScience，Boston，MA)針對 NCBI和Swissprot數(shù)據(jù)庫（SwissInstituteofBioinformatics,Basel,Switzerland) 搜索原始數(shù)據(jù)文件。可信度蛋白質(zhì)鑒定的截斷值為>70。
[0108]結(jié)果:
[0109] 靶抗原與患者之一的血清的免疫沉淀，接著電泳蛋白質(zhì)分離和EZBlue凝膠染色 顯示出在采用對照血清的免疫沉淀中不存在的大約100kDa的獨特條帶（圖1B)。從凝膠切 出該條帶，由質(zhì)譜法分析，證實了它含有衍生自DPPX的序列（得分644U5945和383 ;可信 度蛋白質(zhì)鑒定的截斷值得分>70)。這一發(fā)現(xiàn)被用特異性針對DPPX的抗體對沉淀的免疫印 跡所確認(rèn)（圖1C)。
[0110] 實施例4 :關(guān)于HEK293細(xì)胞的免疫組化
[0111] 用含有大鼠DPPX-S(32個氨基酸的短的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）、DPPX-L(88個氨基酸的 長的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域）、DPPXed-myc(缺失了細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并連接至myc標(biāo)簽的DPPX構(gòu)建 體）、大鼠Kv4.2、人DPPX(DPP6;Origene序列NM_001039350. 1;SEQIDN0:1)、人DPP10 的 質(zhì)粒或沒有插入物的質(zhì)粒（對照）轉(zhuǎn)染J1EK293細(xì)胞。11在其它實驗中，DPPX和Kv4. 2以 等摩爾比共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后，如之前所報道的，評估患者抗體的反應(yīng)性。21為了這個目的， 在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行評估之前將細(xì)胞生長24小時。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被固定于4%低聚甲醛，用0. 1% TritonX-100透化，然后用患者的血清（1:200)或CSF(1:2)和以下抗體之一（依賴于目 的抗原）孵育2小時：DPPX(由BR開發(fā)的兔多克隆抗體1:1000稀釋；兔多克隆抗體abeam 418111:200 稀釋或小鼠單克隆StaCruz#3651471:500 稀釋）、Kv4. 2 (兔多克隆，Alomone labs，#APC_0231:500 稀釋）或myc標(biāo)簽抗體（小鼠單克隆myc標(biāo)簽9Bll，CellSignaling， 1:2000稀釋），以及相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗（山羊抗人IgGAlexaFluor488;山羊抗兔 IgGAlexaFluor555 或山羊抗小鼠IgGAlexaFluor555,均以 1:1000 使用）。采用Zeiss Axiovision軟件（Zeiss，Thornwood，NY)在焚光顯微鏡下對結(jié)果進(jìn)行拍照。
[0112]結(jié)果:
[0113] 轉(zhuǎn)染了大鼠DPPX-S或DPPX-L的HEK293細(xì)胞顯示與患者的血清或CSF類似的反 應(yīng)性，與細(xì)胞外表位的識別一致（圖3顯示與DPPX-L的反應(yīng)性；與DPPX-S獲得類似的反應(yīng) 性，未顯示）?；颊叩目贵w不與表達(dá)Kv4. 2的細(xì)胞反應(yīng)（附圖2)，并且DPPX的反應(yīng)性在其 與Kv4. 2共表達(dá)時并未被改變（數(shù)據(jù)未顯示）。采用其中細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域被缺失的大鼠DPPX 質(zhì)粒（DPPXed-myc)11進(jìn)一步的分析顯示與患者1和4的血清和CSF的反應(yīng)性被消除，以及 與患者2和3的血清和CSF的反應(yīng)性弱，表明后兩位患者具有抗細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)表位的 抗體（附圖3的小圖D和G)。此外，轉(zhuǎn)染了人DPPX的HEK293細(xì)胞還顯示與具有DPPX抗體 的4位患者的血清或CSF的反應(yīng)性（顯示與DPPX的大鼠序列發(fā)生反應(yīng)），而它們與來自10 位健康個體的血清和CSF并不顯示反應(yīng)性。盡管DPPX和DPP10具有51 %的氨基酸序列同 一性，12患者的抗體并不與DPP10反應(yīng)（數(shù)據(jù)未顯示）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)證實，患者的抗 體特異性靶向DPPX而不是Kv4. 2通道，以及一些患者具有抗DPPX的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域的抗體。
[0114] 發(fā)明人接下來在共表達(dá)DPPX和Kv4. 2的基于細(xì)胞的測定中確定149位對照的血 清或CSF的反應(yīng)性。這些受試者中沒有一個被發(fā)現(xiàn)具有與這2種蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體，表明 抗DPPX的抗體對于患有自身免疫性腦炎的患者亞群（subgroup)是特異性的。相反，患有胸 腺瘤和血清陰性重癥肌無力而沒有腦炎的患者（包含于對照中）具有針對DPP10的抗體， 但沒有針對DPPX的抗體（Martinez-Hernandez，數(shù)據(jù)未顯示）。
[0115] 實施例5 :與野生型和DPPX無效小鼠的免疫組化
[0116] 如之前所報道的產(chǎn)生野生型和DPPX無效小鼠并進(jìn)行基因分型。22取出大腦，矢狀 切片，進(jìn)行處理，并采用患者的血清（1:200)或CSF(1:5)通過如針對大鼠大腦所示的標(biāo)準(zhǔn) 抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶免疫組化進(jìn)行檢查。
[0117]結(jié)果:
[0118] 為了進(jìn)一步證實患者的抗體對DPPX的特異性，比較了野生型小鼠大腦與DPPX無 效小鼠大腦的免疫組化。這些實驗證實3位患者的血清或CSF與DPPX無效小鼠的大腦的 反應(yīng)性被消除，表明患者的抗體僅針對DPPX，并且1位患者具有針對未知身份的蛋白質(zhì)的 額外的抗體（圖4H)。
[0119]
【主權(quán)項】
1. 用于受試者中自身免疫性疾病的診斷或治療方法的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于所述多 肽或蛋白質(zhì)包含衍生自蛋白DPPX的一個或更多個表位。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含根據(jù)SEQ ID NO: 1的序列或 其具有至少70%、至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99% 序列同一性的同系物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含根據(jù)SEQ ID N0:2的序列或 其具有至少70%、至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99% 序列同一性的同系物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含根據(jù)SEQ ID N0:3的序列或 其具有至少70%、至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99% 序列同一性的同系物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含根據(jù)SEQ ID N0:4 的序列或其具有至少70%、至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或 至少99%序列同一性的同系物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含根據(jù)SEQ ID N0:2的DPPX的 胞外結(jié)構(gòu)域和根據(jù)SEQ ID N0:3或4的DPPX的胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域，或者其具有至少70%、 至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99 %序列同一性的同系 物。
7. 用于受試者中自身免疫性疾病的診斷或治療方法的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于所述多 肽是根據(jù)權(quán)利要求1至6的多肽或蛋白質(zhì)的片段，其具有根據(jù)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:4 的序列的至少 20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個連續(xù)氨 基酸，或者其中所述多肽是所述片段的具有至少70、至少75、至少80、至少90、至少92、至少 94、至少96、至少98或至少99%序列同一性的同系物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它包含進(jìn)一步的氨基酸， 所述氨基酸是N端或C端連接的并促進(jìn)所述多肽或蛋白質(zhì)的純化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項使用的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于它被連接至報告分子或 固相。
10. 編碼根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多肽或蛋白質(zhì)的核酸。
11. 包含根據(jù)權(quán)利要求10的核酸的載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的載體，特征在于它被調(diào)整用于根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多 肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。
13. 包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的載體的細(xì)胞。
14. 體外診斷方法，特征在于使來自受試者的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多肽 或蛋白質(zhì)接觸并檢測來自該樣品的抗體與該多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)合。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的體外診斷方法，特征在于用免疫熒光檢測、蛋白質(zhì)微陣列、 ELISA、發(fā)光檢測、印跡法、放射免疫檢測、蛋白質(zhì)印跡法或斑點印跡法檢測來自該樣品的抗 體與該多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)合。
16. 用于抗體檢測的檢測試劑盒，特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多肽或 蛋白質(zhì)。
17. 藥物組合物，特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多肽或蛋白質(zhì)。
18. 涂敷有根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的多肽或蛋白質(zhì)或者根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組 合物的醫(yī)療設(shè)備。
19. 用于治療受試者中自身免疫性疾病的方法，該方法包含以下步驟： a. 對來自受試者的液體樣品進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求14或15的體外診斷方法，以及 b. 用至少一種合適的藥物物質(zhì)和/或血漿交換治療該受試者。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述至少一種合適的藥物物質(zhì)選自由以下組成的 組：利妥昔單抗、潑尼松、甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、免疫球蛋白（IVIg)、拉莫三嗪、氯硝西泮、阿 立哌挫（apiriparazole)、苯妥英和霉酷酸莫醋。
21. 用于治療受試者中自身免疫性疾病的方法，該方法包含以下步驟： a. 從受試者取血液或血漿， b. 將所述血液或血漿與根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物或根據(jù)權(quán)利要求18的醫(yī)療設(shè)備 接觸以去除疾病相關(guān)抗體，以及 c. 將所述血液或血漿重新施用給該受試者。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于受試者中自身免疫性疾病的診斷或治療方法的多肽或蛋白質(zhì)，特征在于所述多肽或蛋白質(zhì)包含衍生自蛋白DPPX的一個或更多表位。此外，本發(fā)明涉及編碼這樣的多肽的核酸或載體、包含這樣的載體的細(xì)胞、涉及這樣的多肽的體外診斷方法和檢測試劑盒、包含這樣的多肽的藥物組合物、涂敷有這樣的多肽或藥物組合物的醫(yī)療設(shè)備(device)和用于治療受試者中自身免疫性疾病的方法。
【IPC分類】G01N33-68, C07K14-705, C12N9-48, A61K39-00, A61L31-10
【公開號】CN104640877
【申請?zhí)枴緾N201380047212
【發(fā)明人】J·達(dá)爾茂
【申請人】卡塔蘭研究和高級研究院, 奧古斯特·皮·松耶爾生物醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年9月11日
【公告號】CA2884282A1, EP2895507A1, US20150247847, WO2014041035A1