一種陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因安全領(lǐng)域中轉(zhuǎn)基因作物的安全監(jiān)管和篩查檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及 一種陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近20多年來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)及商業(yè)化迅猛發(fā)展，2013年，全球已有27 種作物涉及336個(gè)轉(zhuǎn)化體獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)，種植面積超過(guò)17. 5億公頃，產(chǎn)生了巨大 的經(jīng)濟(jì)效益（James，BriefsNo. 46http: //www.isaaa.org/purchasepublications/ itemdescription.asp?ItemType=BRIEFS&Control=IB046-2013, 2013)。與此同 時(shí)，轉(zhuǎn)基因生物的安全性問(wèn)題一直備受社會(huì)各界關(guān)注，為此，包括中國(guó)、歐盟、美國(guó)、日本 和韓國(guó)等在內(nèi)50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)紛紛頒布實(shí)施轉(zhuǎn)基因生物安全管理法律法規(guī)，以規(guī)范 轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用（Chassy，GlobalRegulationofTransgenicCrops. MolecularGeneticApproachestoMaizeImprovement,BiotechnologyinAgriculture andForestry, 63, 2009, 107-124)。
[0003] 根據(jù)監(jiān)管需要，研究者針對(duì)不同的檢測(cè)靶標(biāo)開(kāi)發(fā)出了不同的檢測(cè)方法，包括篩查 檢測(cè)方法、構(gòu)建特異性檢測(cè)方法和轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)方法。其中，篩查檢測(cè)方法檢測(cè)的靶 標(biāo)是轉(zhuǎn)基因作物中最常見(jiàn)的通用元件，如CaMV35啟動(dòng)子、N0S終止子等；而轉(zhuǎn)化事件特異性 檢測(cè)方法檢測(cè)的則是同一來(lái)源的轉(zhuǎn)基因植株的特征序列。目前，世界上大多數(shù)國(guó)家均以轉(zhuǎn) 化事件為基礎(chǔ)區(qū)別管理不同的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，不斷有新的轉(zhuǎn)化事件推 出，而且田間試驗(yàn)的頻次也在逐年攀升，若只用事件特異性檢測(cè)方法，容易造成轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 的漏檢。在實(shí)際檢測(cè)和執(zhí)法工作中，檢測(cè)機(jī)構(gòu)首先利用篩查檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行篩查檢測(cè)， 做有無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的判斷。但檢測(cè)工作的開(kāi)展、檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制和溯源都離不開(kāi)標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)。無(wú)論是目前在研的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還是在售的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無(wú)論是基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還是質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)，絕大部分都是基于轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)的需要研制的，沒(méi)有滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè) 需求的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）的缺乏阻礙了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工 作的開(kāi)展。
[0004] 在轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)中，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，只能利用混合的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè) 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟利用轉(zhuǎn)基因玉米Btll和M0N810的混合物作為轉(zhuǎn)基因水 稻篩查檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。但利用轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩查 存在多種問(wèn)題：
[0005] 1、某些特殊的轉(zhuǎn)基因元件沒(méi)有出現(xiàn)在合法的轉(zhuǎn)化事件中，因此也沒(méi)有對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)，如潮霉素抗性基因HPT在實(shí)驗(yàn)室研究中常用，但在商業(yè)化品種中完全沒(méi)有，造成了這 個(gè)元件的檢測(cè)困難；
[0006] 2、一般的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)沒(méi)有考慮各篩查元件的存在與否和拷貝數(shù)比值，當(dāng) 利用多種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合用于轉(zhuǎn)基因篩查時(shí)，某些元件的拷貝數(shù)可能是其他元件的數(shù)倍，在 作為陽(yáng)性對(duì)照使用時(shí)，可能不能準(zhǔn)確反映各檢測(cè)參數(shù)的靈敏度是否一致和符合標(biāo)準(zhǔn)要求；
[0007] 3、不同作物，甚至是同種作物不同品種，其DNA提取效率可能有較大差距，在歐 盟轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中就已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因原材料DNA提取效率存在 30%以上的差異。在將混合的不同轉(zhuǎn)化事件標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因篩查時(shí)，可能某些成分提 取效率與其他成分有較大差異，造成檢測(cè)靈敏度判斷的誤差。
[0008] 在轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)中，部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)根據(jù)檢測(cè)的靶標(biāo)選用含有相應(yīng)靶標(biāo)的轉(zhuǎn)化事 件特異性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照，這樣篩查檢測(cè)中針對(duì)多個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)置了多個(gè)陽(yáng) 性對(duì)照，增大了提取DNA的工作量，而且為了考察DNA質(zhì)量，還要多設(shè)置內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的反應(yīng)， 進(jìn)一步推高了檢測(cè)成本，增大了檢測(cè)的工作量，為檢測(cè)工作造成不便。
[0009] 結(jié)合上述考慮，以解決缺乏轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)這一難題為切入點(diǎn)，克隆 常用轉(zhuǎn)基因篩查元件和作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，聚合構(gòu)建到雙元載體骨架上，研制轉(zhuǎn)基因篩查檢 測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
[0010] 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有專(zhuān)利和其他文獻(xiàn)的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物篩查檢測(cè)通用的 陽(yáng)性質(zhì)粒分子研制和應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的就在于以解決轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作中缺乏轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 這一難題為切入點(diǎn)，克隆常用轉(zhuǎn)基因篩查元件和作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，聚合構(gòu)建到雙元載體骨 架上，提供一種陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening及其應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因作物篩查檢測(cè)提供 陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品。
[0012] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0013] 一、陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening
[0014] 陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening是一種聚合常用篩查元件和六大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) 基因的陽(yáng)性質(zhì)粒分子。
[0015] 1、構(gòu)建
[0016]①設(shè)計(jì)弓丨物Pmif:5'TTACAGCTTGTTGTAAACACGCG3' 和弓丨物Pmir: 5'ATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCA，以轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基因組DNA為模板，擴(kuò)增出PMI基 因序列（SEQN0 2);
[0017]②設(shè)計(jì)引物Te9f:5'GTTCGAGTATTATGGCATTGGGAA3' 和引物Te9r: 5'AGTGITTTACTCCTCATATTAACTTCGG3'，以轉(zhuǎn)基因油菜RT73基因組DNA為模板，擴(kuò)增出 T-e9終止子序列（SEQN0 3);
[0018]③設(shè)計(jì)引物Hptf:5'CTAITTCTTTGCCCTCGGACG3' 和引物Hptr: 5'ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG3'，以轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻基因組DNA為模板，擴(kuò)增出HPT基因 序列（SEQN0 4);
[0019]④設(shè)計(jì)引物T35sf:5'CGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTAC3' 和引物T35sr: 5'AGCTCGGTACCCCTGGAITITG3'，以轉(zhuǎn)基因油菜T45基因組DNA為模板擴(kuò)增出T-CaMV35S終 止子序列（SEQN0 5);
[0020] ⑤設(shè)計(jì)引物F35sf:5'CTCAGGAITTAGCAGCAITCCAGA3' 和引物F35sr: 5'GCTTTATCTTTGCAATAAAGGCAAA3'，以轉(zhuǎn)基因油菜RT73基因組DNA為模板，擴(kuò)增出 P-FMV35S啟動(dòng)子序列（SEQN0 6);
[0021] ⑥設(shè)計(jì)引物Barf: 5 'ATGGACCCAGAACGACGCC3 ' 和引物Tg7r: 5 'AGGCCCGGGCGATA AGAAAAGGCAATTTGTAGAT3'，以轉(zhuǎn)基因油菜MSIXRF1基因組DNA為模板，擴(kuò)增出Bar基因 (SEQN0 7))與T-3g7終止子（SEQN0 8)的融合序列；
[0022] 采用重疊延伸PCR將克隆的6個(gè)片段（PMI、T-e9、HPT、T-CaMV35S、P-FMV35S和 Bar-T-3g7)拼接成一個(gè)大的片段，長(zhǎng)度為4142bp的序列；
[0023] 將拼接的全長(zhǎng)DNA序列經(jīng)Xmal內(nèi)切酶消化后克隆到載體pBI121上；pBI121載 體含有P-N0S啟動(dòng)子和T-N0S終止子調(diào)控表達(dá)的抗性基因NPTII，和P-CaMV35S啟動(dòng)子 和T-N0S終止子調(diào)控表達(dá)的報(bào)告基因GusA;通過(guò)內(nèi)切酶EcoRI和Xmal雙酶切pBI121，剔 除了該載體上報(bào)告基因GusA以及冗余的P-N0S終止子，并保留了pBI121載體上的P-N0S 啟動(dòng)子（SEQNO9)，NPTII(SEQNO10)，T-N0S終止子（SEQN0 11))及P-CaMV35S啟動(dòng) 子（SEQNO12);加上插入的 7 個(gè)外源元件（PMI、T-e9、HPT、T-CaMV35S、P-FMV35S、Bai^P T_3g7)，構(gòu)建的中間載體上一共含有11個(gè)外源元件（圖2);
[0024] 將六大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（水稻SPS、PLD，油菜HMGI/Y、CruA，大豆Lectin、玉米 zSSIlb、棉花Sadie和小麥Waxy-Dl)的檢測(cè)祀標(biāo)序列拼接到一起（圖3)，拼接成一段 長(zhǎng)1742bp的序列（SEQN0 13);將拼接的作物內(nèi)標(biāo)基因融合序列委托上海生工合成，并裝 到PUC57質(zhì)粒上；將6大作物內(nèi)標(biāo)基因融合序列通過(guò)Pmel酶切克隆到裝有11個(gè)外源元 件的中間載體上，構(gòu)建出聚合11個(gè)篩查元件和6大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI 121-Screeing(圖 1)。
[0025] 2、特征
[0026] ①堿基序列如SEQNO. 1所示，其DNA區(qū)含有11個(gè)外源基因元件，和6大作物包括 水稻、油菜、大豆、玉米、棉花和小麥的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因；
[0027] ②位于第9265位至1106位的堿基是六大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性定量檢測(cè)靶標(biāo)的融 合序列，依次是水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS檢測(cè)靶標(biāo)、水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD檢測(cè)靶標(biāo)、大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) 基因Lectin檢測(cè)靶標(biāo)、棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Sadi檢測(cè)靶標(biāo)、油菜內(nèi)標(biāo)基因HMGI/Y檢測(cè)靶標(biāo)、油 菜內(nèi)標(biāo)基因CruA檢測(cè)靶標(biāo)、玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb普檢測(cè)靶標(biāo)和小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Waxy-Dl 檢測(cè)靶標(biāo)；
[0028] ③位于第1103位至18385位的堿基是11個(gè)外源基因元件的融合序列，依次是 P-N0S啟動(dòng)子、NPTII基因、T-N0S終止子、T-CaMV35S終止子、P-CaMV35S啟動(dòng)子、T-3g7終 止子、Bar基因、P-FMV35S啟動(dòng)子、HPT基因、T-e9終止子、Pmi基因；
[0029] ④以上所述序列是陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening的特征序列，可以用作轉(zhuǎn)基 因水稻、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因水稻篩查檢測(cè)時(shí)的陽(yáng) 性對(duì)照和質(zhì)控樣品。
[0030] 二、陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening的應(yīng)用
[0031] 1、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)水稻樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成 分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0032] 合成水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS(PLD)和外源基因元件的引物組合（引物/探針組合）； 提取樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì)陽(yáng)性 質(zhì)粒分子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色 后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn) 物；在陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò)增產(chǎn) 物則說(shuō)明水稻樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0033] 2、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)油菜樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成 分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0034] 合成油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMGI/Y(CruA)和外源基因元件的引物組合（引物/探針組 合）；提取樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì) 陽(yáng)性質(zhì)粒分子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò) 增產(chǎn)物；在陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò) 增產(chǎn)物則說(shuō)明油菜樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0035] 3、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)大豆樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成 分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0036] 合成大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和外源基因元件的引物組合（引物/探針組合）；提 取樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒 分子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒 定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn)物； 在陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò)增產(chǎn)物則 說(shuō)明大豆樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0037] 4、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)玉米樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 成分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0038] 合成玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIlb和外源基因元件的引物組合（引物/探針組合）； 提取樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì)陽(yáng)性 質(zhì)粒分子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色 后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn) 物；在陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò)增產(chǎn) 物則說(shuō)明玉米樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0039] 5、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)棉花樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成 分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0040] 合成棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Sadi和外源基因元件的引物組合（引物/探針組合）；提取 樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒分 子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定 是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn)物；在 陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò)增產(chǎn)物則說(shuō) 明棉花樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0041] 6、利用pBI121-Screening作為陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品，對(duì)小麥樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成 分的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR篩查檢測(cè)：
[0042] 合成小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Waxy-Dl和外源基因元件的引物組合（引物/探針組合）； 提取樣品總DNA，分別利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源元件的引物組合（引物/探針組合）對(duì)陽(yáng)性 質(zhì)粒分子和樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；普通PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色 后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物根據(jù)是否有典型擴(kuò)增曲線判斷是否有擴(kuò)增產(chǎn) 物；在陽(yáng)性質(zhì)粒分子正常擴(kuò)增且樣品中小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因正常擴(kuò)增的情況下，如存在擴(kuò)增產(chǎn) 物則說(shuō)明小麥樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0043] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0044] ①提供了轉(zhuǎn)基因作物篩查檢測(cè)通用的陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening;
[0045]②pBI121-Screening聚合了轉(zhuǎn)基因作物篩查檢測(cè)用的11個(gè)常用的篩查檢測(cè)靶 標(biāo)和6大作物的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列；
[0046]③pBI121-Screening可用作轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉 米、轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因小麥篩查檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控樣品；
[0047] ④解決了轉(zhuǎn)基因作物篩查檢測(cè)中缺乏陽(yáng)性對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)品的技術(shù)難題，避免了篩查 檢測(cè)中針對(duì)多個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)置多個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的問(wèn)題，降低了制備多個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的人力成本 和經(jīng)濟(jì)成本；
[0048] ⑤適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn) 基因小麥及其制品實(shí)施篩查檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和安全監(jiān)管。
【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1是陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening結(jié)構(gòu)圖；
[0050] 圖2是轉(zhuǎn)基因篩查檢測(cè)用11個(gè)外源元件的融合結(jié)構(gòu)圖；
[0051] 圖3是六大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的融合結(jié)構(gòu)圖；
[0052] 圖4是采用定性PCR方法驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒分子中11個(gè)外源元件和6大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn) 基因的檢測(cè)革巴標(biāo)
[0053] a、質(zhì)粒分子上外源元件檢測(cè)，靶標(biāo)順序：1、P_CaMV35S引物組合1，2、P_CaMV35S 引物組合2，3、P-CaMV35S引物組合3，4、P-FMV35S引物組合1，5、P-FMV35S引物組合2，6、 P-N0S，7、T-N0S引物組合 1，8、T-N0S引物組合 2,9、T-CaMV35S，10、T-3g7,ll、T-e9,12、PMI， 13、8&1'，14、咿1'11引物組合1，15、咿1'11引物組合2，16、咿1'11引物組合3，17、冊(cè)1' ;
[0054]b、質(zhì)粒分子上6大作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測(cè)，靶標(biāo)順序：1、SPS，2、zSSIIb，3、Sadl，4、 lectin，5、CruA，6、zSSIIb，7、Waxy-Dl〇
[0055] 圖5是采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒分子中11個(gè)外源元件和6大作物內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn)基因的檢測(cè)祀標(biāo)；
[0056] 圖6是利用陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-Screening做陽(yáng)性對(duì)照，采用普通PCR對(duì)部分 水稻、油菜、大豆、玉米、棉花和小麥品種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)。
[0057] a、水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS檢測(cè)
[0058] 樣品順序：1、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1，2、克螟稻，3、科豐6號(hào)，4、LLRICE62,5、pBI 121-Screening；
[0059] b、大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin檢測(cè)
[0060]樣品順序：1、轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127,2、GTS-40-3-2,3、M0N89788,4、pBI 121-Screening；
[0061] c、油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因CruA檢測(cè)
[0062] 樣品順序：1、轉(zhuǎn)基因油菜GT73,2、Topas19/2,3、T45,4、MS1，5、RF1，6RF2、7、MS8， 8、RF3、9、pBI121-Screening;
[0063] d、玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIlb檢測(cè)
[0064] 樣品順序：1、轉(zhuǎn)基因玉米Btl76,2、Btll，3、M0N863,4、MIR604,5、M0N89034,6、 TC1507,7、59122,8、MIR162,9、pBI121-Screening;
[0065] e、棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Sadi檢測(cè)
[0066] 樣品順序：1、轉(zhuǎn)基因棉花M0N1445,2、M0N531，3、M0N15985,4、M0N88913,5、LL25， 6、pBI121-Screening；
[0067] F、小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Waxy-Dl檢測(cè)
[0068] 樣品順序：1、中麥 895,2、新麥 21，3、pBI121-Screening;
[0069] g、P_CaMV35S啟動(dòng)子檢測(cè)
[0070] 樣品順序：l、A5547-127,2、GTS-40-3-2,3、KMDl，4、KF6,5、Topas19/2,6、T45,7、 Bt76,8、Btll，9、M0N1445,10、pBI121-Screening;
[0071] h、P-N0S啟動(dòng)子檢測(cè)
[0072] 樣品順序：l、KMDl，2、MSl，3、RFl，4、RF2,5、pBI121-Screening;
[0073] i、P-FMV35S啟動(dòng)子檢測(cè)
[0074] 樣品順序：1、GT73, 2、M0N89034, 3、pBI121-Screening;
[0075] j、NPTII基因檢測(cè)
[0076] 樣品順序：1、KMD1，2、MS1，3、RF1，4、RF2,5、M0N863,6、M0N1445,7、M0N15985,8、 pBI121_Screening;
[0077] k、Bar基因檢測(cè)
[0078] 樣品順序：1、LLRICR62, 2、MSI，3、MS8,4、RF1，5、RF2,6、RF3, 7、LL25,8、BT176,9、 pBI121_Screening;
[0079] 1、HPT基因檢測(cè)
[0080] 樣品順序：1、KMD1，2、KF6, 3、pBI121-Screening;
[0081 ]m、PMI基因檢測(cè)
[0082] 樣品順序：l、MIR604,2、3272,3、MIR162,4、pBI121-Screening;
[0083] n、T-NOS終止子檢測(cè)
[0084] 樣品順序：1、TT51-1，2、KF6,3、MS1，4、RF1，5、RF2,6、BT11，7、M0N863,8、 GTS40-3-2,9、M0N1445,10、pBI121-Screening;
[0085] q、T_CaMV35S終止子檢測(cè)
[0086] 樣品順序：1、KF6,2、LLRICR62,3、T0PAS19-2,4、T45,5BT176,6、TC1507,7、3272,8、 MIR162,9、A5547-127,10、pBI121-Screening;
[0087] p、T_e9終止子檢測(cè)
[0088] 樣品順序：l、GT73,2、M0N89788,3、M0N1445,4、M0N88913,5、pBI121-Screening;
[0089] q、T_3g7終止子檢測(cè)
[0090] 樣品順序：1