檢測(cè)核酸的制作方法
【專利說(shuō)明】檢測(cè)核酸
[0001] 本申請(qǐng)是2009. 08. 04提交的CN 200980141331. 4,題為"檢測(cè)核酸"的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2008年8月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/089, 392和2009年 4月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/166, 843的優(yōu)先權(quán)。在先申請(qǐng)的公開內(nèi)容被認(rèn)為是 本申請(qǐng)的一部分，并在此引入以供參考。
【背景技術(shù)】
[0004] 1.技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本申請(qǐng)涉及與檢測(cè)核酸有關(guān)的方法和材料。例如，本申請(qǐng)涉及與用限制性內(nèi)切核 酸酶的酶促擴(kuò)增級(jí)聯(lián)檢測(cè)核酸有關(guān)的方法和材料。
[0006] 2.【背景技術(shù)】
[0007] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種常用的擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的技術(shù)。例如，實(shí)時(shí)PCR可 用于擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的少量模板DNA。通常PCR涉及向認(rèn)為含有待擴(kuò)增目標(biāo)核酸的樣品 中加入一對(duì)核酸引物和熱穩(wěn)定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。使含有引物對(duì)和聚合酶的樣 品經(jīng)歷熱循環(huán)啟動(dòng)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中位于引物之間的目標(biāo)核酸模板指數(shù)擴(kuò)增?？捎媚z電泳 等技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的模板是否存在，或擴(kuò)增的模板量可以采用涉及使用熒光標(biāo)記探針的技術(shù) 評(píng)估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)目標(biāo)核酸的方法和材料。例如，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)樣品中目標(biāo) 核酸存在與否的方法和材料，檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸量的方法和材料，檢測(cè)樣品中目標(biāo)核酸 存在與否的試劑盒，檢測(cè)樣品中存在的目標(biāo)核酸量的試劑盒，以及制備該試劑盒的方法?？?的說(shuō)，本文提供的方法和材料可包括進(jìn)行如本文所述的限制性內(nèi)切核酸酶的酶促擴(kuò)增級(jí) 聯(lián)，以迅速、低廉、靈敏、特異的方式檢測(cè)目標(biāo)核酸。在一些情況下，本文提供的方法和材料 能夠補(bǔ)充或代替目前基于PCR的核酸檢測(cè)方法。
[0009] 本文提供的方法和材料能夠讓臨床人員、專業(yè)醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室人員、和研宄人員檢測(cè) 任何類型的目標(biāo)核酸。例如，本文提供的方法和材料能夠用于基因定型應(yīng)用，以檢測(cè)核酸突 變（例如單核苷酸多態(tài)性（SNP))、基因組重組和基因組表觀遺傳事件（例如DNA甲基化事 件），可用于診斷和預(yù)后應(yīng)用，以檢測(cè)病毒或微生物（例如細(xì)菌、真菌、和原生動(dòng)物），可用于 基因表達(dá)應(yīng)用，以檢測(cè)特定細(xì)胞類型中的mRNA水平，還可用于法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，以比較樣品之 間的一致性或評(píng)估樣品來(lái)源。在一些情況下，本文提供的方法和材料可被醫(yī)學(xué)/生物技術(shù) 專業(yè)以外的人用于檢測(cè)目標(biāo)核酸。例如，本文提供的檢測(cè)細(xì)菌（例如大腸桿菌）的試劑盒 可以設(shè)計(jì)用作家用檢測(cè)試劑盒，從而讓使用者能夠檢測(cè)其獲得的生物學(xué)樣品（例如血樣、 黏液樣品、或唾液樣品）中大腸桿菌核酸的存在與否
[0010] -般說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種評(píng)估樣品中目標(biāo)核酸的方法。該方法包括或主 要由以下組成：(a)使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核 酸酶和在下述條件下與所述目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列：如果所述目標(biāo)核酸存在于 所述樣品中，所述目標(biāo)核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限 制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，（b)使所述核酸的雙鏈部分與識(shí)別性限制性 內(nèi)切核酸酶接觸，所述限制性內(nèi)切核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位 點(diǎn)處切開所述核酸的雙鏈部分：所述識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶 切位點(diǎn)切開所述核酸的雙鏈部分，從而使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸 酶的部分與所述探針核酸的至少一部分分離；（c)使所述探針核酸中含有所述擴(kuò)增性限制 性內(nèi)切核酸酶的部分與含有核酸雙鏈部分的報(bào)道核酸接觸，所述核酸雙鏈部分含有所述擴(kuò) 增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，所述接觸的條件是其中所述擴(kuò)增性 限制性內(nèi)切核酸酶在所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切 開所述報(bào)道核酸，從而使所述報(bào)道核酸的一部分與所述報(bào)道核酸的至少另一部分分離，和 (d)確定所述報(bào)道核酸的所述部分是否存在，其中所述報(bào)道核酸的所述部分存在表明所述 樣品含有所述目標(biāo)核酸，其中所述報(bào)道核酸的所述部分不存在表明所述樣品不含所述目標(biāo) 核酸。探針核酸可以是單鏈探針核酸。探針核酸可以結(jié)合在固相載體上。探針核酸可以直 接結(jié)合在固相載體上。包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分通過(guò)所述步驟（b) 從固相載體上釋放。步驟（a)和步驟（b)是在同一區(qū)室中進(jìn)行的。步驟（a)和步驟（b)在 第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟（c)是在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟（a)和步驟（b)是通過(guò)將所述樣品 加到含有探針核酸和識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。探針核酸包含（i)單鏈部 分，單鏈部分含有與目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及（ii)雙鏈部分。探針核酸包含 第一核酸鏈，其含有與所述目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切 核酸酶的第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相 載體上。第二核酸鏈的一部分與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包含所述擴(kuò)增性限制性 內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一個(gè)部分在步驟（b)中分離，探針核酸 的部分包含第一核酸鏈的一部分和全部第二鏈。包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸 的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟（b)中分離，探針核酸的部分包含目標(biāo)核酸的至 少一部分。該方法包括在步驟（a)中使用多個(gè)所述探針核酸。該方法包括在步驟（c)中使 用多個(gè)報(bào)道核酸。步驟（c)中的報(bào)道核酸相對(duì)于來(lái)自步驟（b)的含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核 酸酶的探針核酸的部分摩爾過(guò)量。在步驟（b)中與所述探針核酸的至少另一部分分離的含 有所述擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分的分子數(shù)基本上與所述樣品中存在的 所述目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。報(bào)道核酸可結(jié)合在固相載體上。報(bào)道核酸可直接結(jié)合 在固相載體上。報(bào)道核酸可包含核酸的單鏈部分。報(bào)道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光 標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。與報(bào)道核酸的所述至少另一部分分離的報(bào)道 核酸的部分可包含所述標(biāo)記。報(bào)道核酸可包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈可包含所述標(biāo) 記，與第二核酸鏈雜交。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載 體上。第一核酸鏈的一部分可與第二核酸鏈雜交，形成包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限 制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。報(bào)道核酸可包含第三核酸鏈。第三核酸鏈的 一部分可與所述第二核酸鏈雜交，形成包含擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶 酶切位點(diǎn)的核酸的雙鏈部分。報(bào)道核酸可結(jié)合在固相載體上，報(bào)道核酸的部分與報(bào)道核酸 的至少另一部分分離，且含有標(biāo)記，該部分在步驟（c)中從固相載體上釋放。確定步驟（d) 可包括檢測(cè)所述標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記，確定步驟（d)可包括檢測(cè)熒光標(biāo)記。確定步 驟（d)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測(cè)與報(bào)道核酸的至少另一部分分離的報(bào)道核酸的部分。步 驟（a)、（b)和（c)可不經(jīng)過(guò)核酸擴(kuò)增。步驟（a)，（b)，（c)，和（d)可不經(jīng)過(guò)核酸擴(kuò)增。確 定步驟可包括確定存在于樣品內(nèi)的目標(biāo)核酸的量。
[0011] 在另一個(gè)方面，本文描述了 一種評(píng)估樣品中的目標(biāo)核酸的方法。該方法包括或主 要由以下步驟組成：(a)使樣品與探針核酸接觸，探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核 酸酶和在下述條件下與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列：如果目標(biāo)核酸存在于樣品中， 目標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位 點(diǎn)的核酸的雙鏈部分，（b)使核酸的雙鏈部分與識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，限制性內(nèi) 切核酸酶能在下述條件下在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開核酸的雙鏈部分：識(shí)別性限 制性內(nèi)切核酸酶在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開核酸的雙鏈部分，從而使探針核酸含有 起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與探針核酸的至少一部分分離；（c)使探針核酸含有 起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與第一信號(hào)放大核酸接觸，第一信號(hào)放大核酸包含第 二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸 酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增 性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第一信號(hào)放大核酸，從而將包含第 二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號(hào)放大核酸的部分與第一核酸的至少另一部分分離； (d)使包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號(hào)放大核酸的部分與第二信號(hào)放大核酸 接觸，第二信號(hào)放大核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分 包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是第二擴(kuò)增 性限制性內(nèi)切核酸酶在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開 第二信號(hào)放大核酸，從而使含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸的部分與第二信 號(hào)放大核酸的至少另一部分分離；（e)使（i)包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核 酸的部分，（ii)包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二信號(hào)放大核酸的部分，（iii)包 含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一信號(hào)放大核酸的部分，或（iv)其任何組合與包含 核酸的雙鏈部分的報(bào)道核酸接觸，該部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切 核酸酶酶切位點(diǎn)和/或第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸 的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核 酸酶酶切位點(diǎn)切開報(bào)道核酸，從而將報(bào)道核酸的一部分與報(bào)道核酸的至少另一部分分開， 和（f)確定所述報(bào)道核酸部分是否存在，其中所述報(bào)道核酸部分存在表明樣品含有目標(biāo)核 酸，其中所述報(bào)道核酸部分不存在表明樣品不含目標(biāo)核酸。探針核酸可以是單鏈探針核酸。 探針核酸可結(jié)合在固相載體上。探針核酸可直接結(jié)合在固相載體上。包含起始擴(kuò)增性限制 性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部分通過(guò)所述步驟（b)從固相載體上釋放。步驟（a)和步驟（b) 可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟（c)和步驟（d)可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟（a)和步驟（b)可 在第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟（c)和步驟（d)可在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟（a)和步驟（b)是通過(guò) 將所述樣品加到含有所述探針核酸和所述識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行的。步驟 (c)和步驟（d)是通過(guò)將含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分加入到含有 所述第一信號(hào)放大核酸和第二信號(hào)放大核酸的區(qū)室中進(jìn)行的。探針核酸可包含（i)單鏈部 分，單鏈部分含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及（ii)雙鏈部分。探針核酸可 包含第一核酸鏈，第一核酸鏈可含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有起始擴(kuò) 增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈 可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈的一部分可與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包 含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟（b) 中分離，探針核酸的該部分可包含第一核酸鏈的一部分和全部第二鏈。包含起始擴(kuò)增性限 制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟（b)中分離，探針核 酸的該部分可包含目標(biāo)核酸的至少一部分。該方法可包括在步驟（a)中使用多個(gè)所述探針 核酸。該方法可包括在步驟（e)中使用多個(gè)報(bào)道核酸。步驟（e)中的報(bào)道核酸相對(duì)于來(lái)自 步驟（b)的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的所述探針核酸的部分摩爾過(guò)量。在步驟 (b)中與所述探針核酸的至少另一部分分離的含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核 酸的部分的分子數(shù)基本上與樣品中存在的目標(biāo)核酸的分子數(shù)成線性關(guān)系。第一信號(hào)放大核 酸和第二信號(hào)放大核酸可結(jié)合在固相載體上。第一信號(hào)放大核酸和第二信號(hào)放大核酸可直 接結(jié)合在固相載體上。第一信號(hào)放大核酸和第二信號(hào)放大核酸在同一區(qū)室中結(jié)合在固相載 體上。第一信號(hào)放大核酸中包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過(guò)步驟（c)從固相 載體上釋放。第二信號(hào)放大核酸中包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分通過(guò)步驟（d) 從固相載體上釋放。第一信號(hào)放大核酸可包含第一核酸鏈，該第一核酸鏈包含第二擴(kuò)增性 限制性內(nèi)切核酸酶，與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性 限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一 核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié) 合在固相載體上。第二信號(hào)放大核酸可包含第一核酸鏈，其包含所述起始擴(kuò)增性限制性內(nèi) 切核酸酶，第一核酸鏈與第二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該雙鏈部分包含第二擴(kuò)增 性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第 一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接 結(jié)合在固相載體上。報(bào)道核酸可結(jié)合在固相載體上。報(bào)道核酸可直接結(jié)合在固相載體上。 報(bào)道核酸可包含核酸的單鏈部分。報(bào)道核酸可包含標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo) 記、酶標(biāo)記、或氧化還原標(biāo)記。與報(bào)道核酸的至少另一部分分離的報(bào)道核酸的部分包含標(biāo) 記。報(bào)道核酸可包含第一核酸鏈，所述第一核酸鏈包含標(biāo)記，與第二核酸鏈雜交。第二核酸 鏈可結(jié)合在固相載體上。第二核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈的一部分與第 二核酸鏈雜交，形成核酸的雙鏈部分，該部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性 內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。報(bào)道核酸可包含第三核酸鏈。第三核酸鏈可與第二核酸鏈雜交，形成 核酸的雙鏈部分，包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。報(bào)道 核酸可結(jié)合在固相載體上，報(bào)道核酸中與報(bào)道核酸的至少另一部分分離并含有標(biāo)記的部分 在步驟（e)中從固相載體上釋放。確定步驟（f)可包括檢測(cè)標(biāo)記。標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記， 確定步驟（f)可包括檢測(cè)熒光標(biāo)記。確定步驟（f)可包括用毛細(xì)電泳技術(shù)檢測(cè)與報(bào)道核酸 的至少另一部分分離的報(bào)道核酸部分。步驟（a)、（b)、（c)、（d)和（e)可不經(jīng)過(guò)核酸擴(kuò)增。 步驟（a)，（b)，（c)，（d)，（e)和（f)可不經(jīng)過(guò)核酸擴(kuò)增。確定步驟可包括確定存在于樣品內(nèi) 的目標(biāo)核酸的量。
[0012] 在另一方面，本文描述了一種評(píng)估樣品中的目標(biāo)核酸的方法。該方法包括，或主要 由以下步驟組成：(a)使樣品與探針核酸接觸，探針核酸包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸 酶和在下述條件下與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列：如果目標(biāo)核酸存在于樣品中，目 標(biāo)核酸的至少一部分與探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn) 的核酸的雙鏈部分，（b)使核酸的雙鏈部分與識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，限制性內(nèi)切核 酸酶能在下述條件下在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)處切開核酸的雙鏈部分：識(shí)別性限制性 內(nèi)切核酸酶在限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開核酸的雙鏈部分，從而使探針核酸中含有起 始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與探針核酸的至少另一部分分離；（c)使探針核酸中含 有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的部分與第一報(bào)道核酸（或第一信號(hào)放大核酸）接觸，其 包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi) 切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶在起 始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第一報(bào)道核酸，從而將包含 第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一核酸的部分與第一核酸的至少另一部分分離；（d)使 包含第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第一報(bào)道核酸的部分與第二報(bào)道核酸（或第二信號(hào) 放大核酸）接觸，其包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶和核酸的雙鏈部分，雙鏈部分包含 第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)，接觸的條件是起始擴(kuò)增性限 制性內(nèi)切核酸酶在第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)切開第二 核酸，從而使含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的第二核酸的部分與第二核酸的至少另一 部分分離；和（e)確定第一報(bào)道核酸，第二報(bào)道核酸，或第一和第二報(bào)道核酸的部分是否存 在，其中存在表明樣品含有目標(biāo)核酸，而不存在表明樣品不含目標(biāo)核酸。探針核酸可以是單 鏈探針核酸。探針核酸可結(jié)合在固相載體上。探針核酸可直接結(jié)合在固相載體上。包含起 始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分通過(guò)步驟（b)從固相載體上釋放。步驟（a) 和步驟（b)可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟（c)和步驟（d)可在同一區(qū)室中進(jìn)行。步驟（a)和 步驟（b)可在第一區(qū)室中進(jìn)行，步驟（c)和步驟（d)可在第二區(qū)室中進(jìn)行。步驟（a)和步 驟（b)可通過(guò)將所述樣品加到含有探針核酸和識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進(jìn)行。步 驟（c)和步驟（d)可通過(guò)將含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸的部分加入含有 第一報(bào)道核酸和所述第二報(bào)道核酸的區(qū)室中進(jìn)行。探針核酸可包含（i)單鏈部分，單鏈部 分含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及（ii)雙鏈部分。探針核酸包含第一核酸 鏈，其含有與目標(biāo)核酸的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，與含有起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的 第二核酸鏈雜交。第一核酸鏈可結(jié)合在固相載體上。第一核酸鏈可直接結(jié)合在固相載體 上。第二核酸鏈的一部分可與第一核酸鏈雜交，形成雙鏈部分。包含起始擴(kuò)增性限制性內(nèi) 切核酸酶的探針核酸的部分與探針核酸的至少另一部分在步驟（b)中分離，探針核酸的部 分包含第一核酸鏈的一部分和