在，那么 在高電極電勢下的電極可氧化還原形式的二茂鐵，從而將其轉(zhuǎn)換成二茂鐵的氧化形式。產(chǎn) 生的電流與溶液中二茂鐵標記的濃度成比例。
[0079] 本文所述的方法和材料可用于實時評估一個或多個樣品中的目標核酸。例如，可 用熒光標記/淬滅劑系統(tǒng)或電化學氧化還原標記系統(tǒng)實時檢測報道核酸和/或信號放大核 酸的酶切。
[0080] 本文提供的方法和材料可用于評估一個或多個（例如兩個、三個、四個、五個、 六個、七個、八個、九個、十個，20個，50個，100個，500個，1000個，或更多）樣品中 一種類型的目標核酸。在一些情況下，本文提供的方法和材料可以多重形式使用，以評 估一個或多個樣品中一種以上（例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十 種，20, 50, 100,500, 1000種或更多種）類型的目標核酸。例如，可用十種不同序列（例如 來自一種菌種或菌株的十種不同序列，或來自十種不同細菌菌種或菌株的不同序列）的目 標核酸設(shè)計10種不同的探針核酸分子。在這些情況下，可用不同標記對應于各探針核酸， 從而使得檢測的信號可表示十種目標核酸中的哪一種被檢測。
[0081] 本文還提供用于進行本文所述方法的試劑盒。例如，本文提供的試劑盒可包含與 固相載體結(jié)合或不結(jié)合的探針核酸，和/或與固相載體結(jié)合或不結(jié)合的報道核酸。在一些 情況下，這樣的試劑盒可包含識別性限制性內(nèi)切核酸酶，第一信號放大核酸，第二信號放大 核酸，或其組合。在一些情況下，試劑盒可配制成微流體裝置，其允許探針核酸、第一信號放 大核酸、第二信號放大核酸、報道核酸或識別性限制性內(nèi)切核酸酶（或其任何組合），以及 任何這些核酸的酶切部分以一定方式運動，所述方式能夠?qū)嵤┍疚奶峁┑臋z測方法，其中 核酸可結(jié)合或不結(jié)合于固相載體。例如，本文提供的試劑盒可以是能夠接受樣品并使樣品 與探針核酸接觸的微流體裝置。可將探針核酸設(shè)計成包含一定長度的核苷酸，其后是與目 標核酸互補的序列，其可產(chǎn)生識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點，然后是擴增性限制性內(nèi) 切核酸酶。識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點與擴增性限制性內(nèi)切核酸酶之間的距離可以 較短（例如100, 50, 25, 10,或更少的核苷酸），而識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點到核 苷酸長度起始的距離可以較長（例如50, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000,個或更長）。在這 樣的情況下，在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點酶切探針核酸可得到較小部分，其含有 擴增性限制性內(nèi)切核酸酶，能比較大的未酶切的探針核酸移動更快速。該區(qū)別能夠使含有 擴增性限制性內(nèi)切核酸酶的經(jīng)酶切的部分到達含有信號放大核酸或報道核酸的微流體裝 置的區(qū)域，從而能在不存在未酶切探針核酸的情況下進行下一步反應。在一些情況下，含有 擴增性限制性內(nèi)切核酸酶的較小的部分到達含有信號放大核酸或報道核酸的區(qū)域后，可用 閥門防止未酶切的探針核酸進入。在一些情況下，可用濾膜限制較大的未酶切的探針核酸 進入下一步反應位置?？稍诒疚奶峁┑姆椒ǖ钠渌襟E中使用類似方法分離酶切的核酸與 未酶切的核酸。
[0082] 在一些情況下，本文提供的試劑盒可以是便攜式或自持裝置、包裝、器皿或容器， 可用于例如現(xiàn)場應用。例如，這樣的試劑盒可配制成讓用戶插入樣品用于分析。一旦插入， 可用試劑盒內(nèi)的加熱或冷卻機構(gòu)加熱樣品（例如加熱到約25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33， 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ，60, 61，62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 80, 85, 90, 95°C或以上）和/或冷卻。例如，可在 試劑盒內(nèi)引發(fā)放熱或吸熱化學反應，從而提高、降低或保持溫度。這樣的放熱或吸熱化學反 應可以在試劑盒內(nèi)進行，而不需要與目標核酸檢測方法的反應物有液體交換。鐵氧化反應 是可用于加熱本文提供的試劑盒的一種放熱化學反應?？捎糜诶鋮s本文提供的試劑盒的一 種吸熱化學反應可以是包括使用氯化銨和水、氯化鉀和水、或碳酸鈉和乙醇酸在內(nèi)的反應。 一般說，當檢測DNA目標核酸時，試劑盒可設(shè)計成在需要的情況下可產(chǎn)生足夠熱量，以使得 樣品內(nèi)存在的雙鏈DNA變性。試劑盒還可設(shè)計成產(chǎn)生足夠的加熱和冷卻溫度，從而能進行 本文提供的檢測方法的每一步。在一些情況下，本文提供的試劑盒可包括溫度指示計（例 如顯色指示劑或溫度計），讓用戶評估溫度。
[0083] 在一些情況下，試劑盒可設(shè)計成對用戶提供測試樣品中目標核酸存在的"是"或 "否"的指示。例如，可使用能夠產(chǎn)生pH變化的標記和可視指示劑（例如基于pH的顯色劑）， 以通過pH的改變通知用戶目標核酸的存在。
[0084] 以下實施例進一步描述了本發(fā)明，這些實施例不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范 圍。 實施例
[0085] 實施例1一目標一探針雜奪物的形成和酶切
[0086] 用巰基在5'末端和生物素分子在3'末端修飾的寡核苷酸探針（5'_巰基-GGT AGT GCG AAA TGC CAT TGC TAG ITG ITT-生物素-3' ；SEQ ID NO:l)與辣根過氧化物酶（HRP) 偶聯(lián)。用SMCC試劑根據(jù)Dill等（生物傳感器和生物電子學，20:736-742(2004))所述的改 良技術(shù)進行偶聯(lián)。HRP偶聯(lián)物溶液與鏈霉親和素包被的ELISA板一起保溫，將HRP-寡核苷 酸探針通過生物素一鏈霉親和素作用固定在其表面。然后，ELISA板與不同濃度的目標寡核 苷酸（5'-AAA CAA CTA GCA ATG GCA ITT-3';SEQ ID NO:2) -起溫育。目標寡核苷酸序列 與探針序列反向互補，形成雙鏈的雜交分子。洗滌后，板在含有限制性內(nèi)切核酸酶Bfal的 溶液中溫育。Bfal特異性識別序列5'-CTAG-3'，并切割雙鏈的目標探針雜交物，將HRP-寡 核苷酸釋放到反應溶液中。37°C溫育2小時后，將反應溶液轉(zhuǎn)移到新的ELISA板中。切開 的HRP-寡核苷酸與3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)接觸，形成有色反應產(chǎn)物。
[0087] 當反應混合物中加入過量的限制性內(nèi)切核酸酶Bfal時，觀察到釋放的HRP-探針 和寡核苷酸目標濃度之間有明顯的直接依賴性（圖6A)?？蓹z測目標濃度約為InM。不經(jīng) 過任何第二信號放大，通過直接測定獲得該檢測極限。如本文所述，加入限制性內(nèi)切核酸酶 信號放大級聯(lián)可以進一步提高幾個數(shù)量級的檢測極限。
[0088] 當HRP -寡核苷酸探針與過量目標寡核苷酸（500nM)預溫育時，酶切的HRP-寡核 苷酸探針量受到識別性限制性內(nèi)切核酸酶Bfal含量的限制（圖6B)。綜上所述，這些數(shù)據(jù) 顯示識別性限制性內(nèi)切核酸酶能夠用于引發(fā)本文所述的限制性內(nèi)切核酸酶級聯(lián)反應。
[0089] 實施例2-用探針核酸和報道核酸檢測目標核酸
[0090] 選擇目標核酸。一旦選定，用常用基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank?和/或基于計算機 的序列分析程序鑒定出目標核酸中含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的部分。設(shè)計與目標核 酸中至少一個含有酶切位點的部分互補的探針核酸。一旦設(shè)計并用標準寡核苷酸合成法獲 得探針核酸，將其與擴增性限制性內(nèi)切核酸酶偶聯(lián)，固定在微量滴定板第一孔表面。要測試 的樣品在第一孔中溫育。如果樣品中存在目標核酸，目標核酸的至少一部分與探針核酸雜 交，從而形成識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點。在具有樣品和探針核酸的第一孔中加入 識別性限制性內(nèi)切核酸酶。微量滴定板在37°C溫育合適的時間，使酶切反應進行。
[0091] 識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸后，含有探針核酸釋放部分的反應溶液被 轉(zhuǎn)移到第二孔中。第二孔含有固定在表面上并含有具有擴增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點 的至少一個雙鏈部分的報道核酸。報道核酸還具有熒光標記。轉(zhuǎn)移到第二室后，結(jié)合在探 針核酸釋放部分的擴增性限制性內(nèi)切核酸酶與報道核酸接觸。擴增性限制性內(nèi)切核酸酶在 雙鏈化的擴增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點酶切報道核酸，形成至少兩個部分。將含有熒 光標記的報道核酸的釋放部分轉(zhuǎn)移到第三微量滴定板孔中，用標準熒光讀數(shù)計測定任何熒 光信號。
[0092] 用已知量目標核酸的標準曲線定量測試樣品中的目標核酸量。
[0093] 實施例3 -用探針核酸、第一信號放大核酸，第二信號放大核酸和報道核酸檢測 目標核酸
[0094] -旦選定，用常用基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank?和/或基于計算機的序列分析程序 鑒定出目標核酸中含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的部分。根據(jù)本文所述，基于所需的目 標核酸設(shè)計探針核酸。使用標準寡核苷酸合成法制備探針核酸，然后將其偶聯(lián)到起始擴增 性限制性內(nèi)切核酸酶上，固定在微量滴定板第一孔表面。在第一孔中溫育將要測試目標核 酸的樣品。如果目標核酸存在于樣品中，目標核酸的至少一部分與探針核酸雜交，因此形成 識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點。將識別性限制性內(nèi)切核酸酶加到具有樣品和探針核酸 的第一孔中。微量滴定板在37°C溫育一段合適的時間，讓酶切反應進行。
[0095] 在識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸：目標核酸雜交物以后，含有探針核酸 游離部分的反應溶液被轉(zhuǎn)移到另一個包含第一信號放大核酸和第二信號放大核酸的孔中。 第一信號放大核酸和第二信號放大核酸產(chǎn)生了正反饋循環(huán)，導致起始擴增性限制性酶的釋 放指數(shù)加快。該孔的反應產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到另一個含有報道核酸的孔中，采用酶切報道核酸確 定樣品中目標核酸的存在與否及其量。用已知量的目標核酸的標準曲線定量測試樣品中的 目標核酸量。
[0096] 實施例4-檢測細菌的存在與否
[0097] 用酶擴增級聯(lián)反應檢測樣品中甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (MRSA)的存在與否。用常規(guī)基因數(shù)據(jù)庫，例如GenBank和/或基于計算機的序列分 析程序分析MRSA特異性目標核酸，以鑒定出含有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的目標核酸 部分。設(shè)計與所選目標核酸至少一部分互補的探針核酸。一旦設(shè)計并用標準寡核苷酸合成 法獲得探針核酸，將其與擴增性限制性內(nèi)切核酸酶偶聯(lián)，固定在微量滴定板的第一孔表面。 獲得懷疑含有MRSA的生物學樣品（例如組織樣品或鼻拭子），在第一孔中保溫來自該樣品 的核酸。如果樣品中存在MRSA，至少一部分MRSA特異性核酸與探針核酸雜交，從而形成識 別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點。在含有樣品和探針核酸的第一孔中加入識別性限制性內(nèi) 切核酸酶。微量滴定板在37°C保溫一段合適的時間，以進行酶切反應。
[0098] 在用識別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切探針核酸：目標核酸雜交物后，第一孔中的反 應溶液被轉(zhuǎn)移到含有報道核酸的第二孔中，該報道核酸被固定在第二孔表面并具有含擴增 性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的至少一個雙鏈部分。報道核酸也具有熒光標記。在某些情 況下，在報道核酸步驟前使用第一信號放大核酸和第二信號放大核酸，以提高目標核酸的 檢測水平。第一信號放大核酸和第二信號放大核酸可以包括標記，此時它們與報道核酸一 起使用或者代替報道核酸使用。
[0099] 將反應混合物轉(zhuǎn)移到第二室后，探針核酸被釋放部分的擴增性限制性核酸內(nèi)切酶 接觸報道核酸，將微量滴定板在合適的溫度下（例如37°C下）培養(yǎng)一段合適的時間，以進行 酶切反應。擴增性限制性內(nèi)切核酸酶在雙鏈擴增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點切開報道核 酸，形成至少兩部分。第二孔的反應溶液被轉(zhuǎn)移到第三孔，用熒光微量滴定板讀數(shù)計檢測熒 光。第三孔中的熒光表明在樣品中存在MRSA特異性核酸。如果樣品獲自病人，這樣的結(jié)果 表示在該病人中有MRSA感染。如果在第三孔中沒有檢測到熒光，這樣的結(jié)果表明在樣品中 不存在MRSA。
[0100] 其它實施方式
[0101] 應理解，雖然已經(jīng)結(jié)合發(fā)明詳述描述了本發(fā)明，但是上面的詳述旨在說明而非限 制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、益處和修改落在所附權(quán)利 要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種評估樣品中的目標核酸的方法，其特征在于，所述方法包括： (a) 使所述樣品與探針核酸接觸，所述探針核酸包含擴增性限制性內(nèi)切核酸酶和在下 述條件下與所述目標核酸的序列互補的核苷酸序列：如果所述目標核酸存在于所述樣品 中，所述目標核酸的至少一部分與所述探針核酸的至少一部分雜交，形成含有限制性內(nèi)切 核酸酶切割位點的核酸的雙鏈部分， (b) 使所述核酸的雙鏈部分與識別性限制性內(nèi)切核酸酶接觸，所述識別性限制性內(nèi)切 核酸酶能在下述條件下在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點處切開所述核酸的雙鏈部分：所 述識別性限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點切開所述核酸的雙鏈部分， 從而使所述探針核酸中含有所述限制性內(nèi)切核酸酶的部分與所述探針核酸的至少另一部 分分咼； (c) 使所述探針核酸中含有所述限制性內(nèi)切核酸酶的所述部分與含有擴增性限制性內(nèi) 切核酸酶的信號放大核酸接觸，所述信號放大核酸包含擴增性限制性內(nèi)切核酸酶、標記、以 及含有所述限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的核酸雙鏈部分，所述接觸的 條件是其中所述限制性內(nèi)切核酸酶在所述限制性內(nèi)切核酸酶的所述限制性內(nèi)切核酸酶酶 切位點切開所述信號放大核酸，從而使所述信號放大核酸的第一部分與所述信號放大核酸 的至少另一部分分離，其中所述第一部分包含所述標記，和 (d) 用所述標記確定所述第一部分的存在與否，其中所述第一部分的存在表明所述樣 品含有所述目標核酸，其中所述第一部分不存在表明所述樣品不含所述目標核酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含第一核酸鏈，所述第一核 酸鏈含有與所述目標核酸的所述序列互補的核苷酸序列，與含有所述限制性內(nèi)切核酸酶的 第二核酸鏈雜交。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針核酸結(jié)合在固相載體上。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針核酸中包含所述限制性內(nèi)切核酸 酶的所述部分通過所述步驟（b)從所述固相載體上釋放。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針核酸包含核酸鏈，所述核酸鏈含有 與所述目標核酸的所述序列互補的所述核苷酸序列、所述限制性內(nèi)切核酸酶、和生物素。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述探針核酸通過鏈霉親和素結(jié)合在固相 載體上。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（a)和步驟（b)是在同一區(qū)室中進 行的。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（a)和步驟（b)是通過將所述樣品 加到含有所述探針核酸和所述識別性限制性內(nèi)切核酸酶的區(qū)室中進行的。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號放大核酸包含第一核酸鏈，所述第 一核酸鏈包含所述擴增性限制性內(nèi)切核酸酶；和包含所述標記的第二核酸鏈。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述信號放大核酸結(jié)合在固相載體上。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述信號放大核酸包含含有生物素的核 酸鏈。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述信號放大核酸通過鏈霉親和素結(jié)合 在固相載體上。
13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標記是熒光標記、放射性標記、酶標 記、或氧化還原標記。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（a)、(b)和（c)不經(jīng)過核酸擴增， 或所述步驟（a)，（b)，（c)，和（d)不經(jīng)過核酸擴增。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定步驟包括確定存在于所述樣品內(nèi) 的所述目標核酸的量。
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝藱z測目標核酸的方法和材料。提供了例如，用于檢測目標核酸存在與否的方法和材料，用于檢測存在于樣品中的目標核酸量的方法和材料，用于檢測目標核酸存在與否的試劑盒，用于檢測存在于樣品中的目標核酸量的試劑盒，以及制備這樣的試劑盒的方法。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104673888
【申請?zhí)枴緾N201410692008
【發(fā)明人】K·D·史密斯, N·亞茲溫科, M·施密特
【申請人】卡斯凱德生物體系股份有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2009年8月4日
【公告號】CA2734244A1, CN102186997A, CN102186997B, EP2318549A2, EP2318549A4, EP2318549B1, EP2586876A1, EP2586876B1, EP2808403A1, US8278048, US8632974, US8865407, US20100041049, US20130005603, US20140113292, US20150004609, WO2010019414A2, WO2010019414A3