10-200個(gè)核苷酸，約10-100個(gè)核苷酸，約10-50個(gè)核苷酸，約10-25個(gè)核苷酸， 約20-500個(gè)核苷酸，約30-500個(gè)核苷酸，約40-500個(gè)核苷酸，約50-500個(gè)核苷酸，約 75-500個(gè)核苷酸，約100-500個(gè)核苷酸，約150-500個(gè)核苷酸，約15-50個(gè)核苷酸，約 15-25個(gè)核苷酸，約20-50個(gè)核苷酸，或約18-25個(gè)核苷酸）。
[0065] 本文所述的信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以 是任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。另外，可用任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作 為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶來酶切信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸?？捎米鲾U(kuò)增性限制性內(nèi)切核 酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI，EcoRII，BamHI，Hindlll，TaqI，Notl， Hinfl, Sau3A, PovII, Smal, Haelll, Hgal, Alul, EcoRV, EcoP15I, Kpnl, PstI, SacI, Sail, Sea I, SphI, StuI, Xbal, Aarl, Banll, BseGI, BspPI, CfrI, EcoNI, Hsp92II, NlalV, Rsal, Tail, Aa si, Bbsl, BseJI, BspTI, Clal, Eco0109I, I-Ppol, NmuCI, RsrII, Taqal, Aatll, Bbul, BseLI, B srBI, Cpol, KasI, Acc65I, BbvCI, BseMI, BsrDI, Csp45I,, Kpn2I, Nrul, SacII, TasI, AccB7I, Bbvl, BseMII, BsrFI, Csp6I, Ehel, Kpnl, Nsbl, Sail, Tati, AccI, BceAI, BseNI, BsrGI, CspI, Esp3I, KspAI, Nsil, SapI,和Taul限制性內(nèi)切核酸酶。
[0066] -般說，信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸可設(shè)計(jì)成具有雙鏈區(qū)段，其含有一個(gè)擴(kuò)增性限 制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在一些情況下，本文所述的信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸可設(shè)計(jì)成 具有雙鏈區(qū)段，其含有一個(gè)以上（例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè) 或更多）的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。當(dāng)使用一個(gè)以上擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶 酶切位點(diǎn)時(shí)，多個(gè)擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)可以是同一限制性內(nèi)切核酸酶的酶切 位點(diǎn)或不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)。例如，報(bào)道核酸可設(shè)計(jì)成具有雙鏈區(qū)段，其含 有EcoRI起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一個(gè)起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)和 Xbal第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的一個(gè)第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。
[0067] 可用任何合適的方法獲得信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸的核酸組分。例如，可用常 用的分子克隆和化學(xué)核酸合成技術(shù)獲得信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸的核酸組分。在一些情 況下，信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸的核酸組分可以用市售的自動(dòng)化核苷酸合成儀合成，例如 那些購自加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的。在一些情況下，信號(hào)放大核酸 或報(bào)道核酸可用任意數(shù)量的本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的方法從頭合成。這樣的合成方法的例子包 括但不限于0-氰基乙基亞磷酰胺法（Beaucage等，四面體通信，22:1859-1862 (1981)) 和核苷H-膦酸鹽法（Garegg等，四面體通信，27:4051-4054(1986) ;Froehler等，核酸研 宄，14:5399-5407(1986) ;Garegg等?，四面體通信，27:4055-4058(1986);和 Gaffney 等， 四面體通信，29:2619-2622 (1988))。這些方法可以用各種市售自動(dòng)化核苷酸合成儀進(jìn)行。 在一些情況下，諸如PCR等重組核酸技術(shù)和包括使用限制性酶消化和連接現(xiàn)存核酸序列 (例如基因組DNA或cDNA的）的那些技術(shù)可用于獲得探針核酸的核酸組分。
[0068] 本文所述的信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸可結(jié)合在固相載體上。固相載體的例子包括 但不限于微量滴定板孔（例如96-孔微量滴定板孔或ELISA板），珠（例如磁性、玻璃、塑 料或金包裹的珠），載玻片（例如玻璃或金包裹的載玻片）、微米或納米顆粒（例如碳納米 管）、鉑固相載體、鈀固相載體和微流化裝置中室或通道的表面。在一些情況下，固相載體 可以是基于氧化硅的固相載體、基于塑料聚合物的固相載體（例如尼龍、硝基纖維素或基 于聚氟乙烯的固相載體），或基于生物聚合物（例如交聯(lián)葡聚糖或基于纖維素的固相載體） 的固相載體。
[0069] 信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸可直接或間接結(jié)合于固相載體。例如，生物素可以是信 號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸的組分，含有生物素的信號(hào)放大核酸或報(bào)道核酸可通過生物素-鏈 霉親和素相互作用間接結(jié)合在鏈霉親和素包被的固相載體上。在一些情況下，信號(hào)放大核 酸或報(bào)道核酸可通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用結(jié)合于固相載體。例如，信號(hào)放大核酸或報(bào)道 核酸可與他處描述的磁珠共價(jià)結(jié)合（Albretsen等，分析生物化學(xué)，189(1) : 40-50 (1990))。
[0070] 信號(hào)放大核酸可設(shè)計(jì)成含有任何類型的限制性內(nèi)切核酸酶作為擴(kuò)增性限制性內(nèi) 切核酸酶（例如起始擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶、第二擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶、或第三擴(kuò) 增性限制性內(nèi)切核酸酶）。一般說，信號(hào)放大核酸的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶通常是與用作 識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶不同的限制性內(nèi)切核酸酶。例如，當(dāng)EcoRI 限制性內(nèi)切核酸酶用作識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶時(shí)，用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶以外的限 制性內(nèi)切核酸酶（例如Healll限制性內(nèi)切核酸酶）作為擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶?？捎?作擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的限制性內(nèi)切核酸酶的例子包括但不限于EcoRI，EcoRII，BamH I, Hindlll, TaqI, Notl, Hinf I, Sau3A, PovII, Smal, Haelll, Hgal, Alul, EcoRV, EcoP15I, Kpn I, PstI, SacI, Sail, Seal, SphI, StuI, Xbal, Aarl, Banll, BseGI, BspPI, CfrI, EcoNI, Hsp92I I, NlalV, Rsal, Tail, AasI, Bbsl, BseJI, BspTI, Clal, Eco0109I, I-Ppol, NmuCI, RsrII, Taqa I, Aatll, Bbul, BseLI, BsrBI, Cpol, KasI, Acc65I, BbvCI, BseMI, BsrDI, Csp45I,, Kpn2I, Nru I, SacII, TasI, AccB7I, Bbvl, BseMII, BsrFI, Csp6I, Ehel, Kpnl, Nsbl, Sail, Tati, AccI, Bee AI, BseNI, BsrGI, CspI, Esp3I, KspAI, Nsil, SapI,和 Taul 限制性內(nèi)切核酸酶。任何數(shù)量的 同一擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的分子可結(jié)合于一個(gè)信號(hào)放大核酸分子。例如，一個(gè)信號(hào)放 大核酸分子可含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、或更多個(gè)EcoRI擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶 分子。在一些情況下，一個(gè)信號(hào)放大核酸分子可含有兩個(gè)或多個(gè)（例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五 個(gè)或更多個(gè)）不同類型的擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶。例如，一個(gè)信號(hào)放大核酸分子可含有 三個(gè)Banll擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子和兩個(gè)SacII擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶分子。 [0071] 報(bào)道核酸可設(shè)計(jì)成含有標(biāo)記，以幫助檢測酶切的報(bào)道核酸。在一些情況下，信號(hào) 放大核酸可設(shè)計(jì)成含有標(biāo)記。在這些情況下，含有標(biāo)記的信號(hào)放大核酸可與報(bào)道核酸一起 使用，或代替報(bào)道核酸檢測目標(biāo)核酸。可以是報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸的組分的標(biāo)記的例 子包括但不限于熒光標(biāo)記（使用或不使用淬滅劑）、染料、抗體、放射性物質(zhì)、酶（例如辣根 過氧化物酶、堿性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或熒光酶）、氧化還原標(biāo)記物（例如鐵氧還標(biāo) 記）、金屬顆粒（例如金納米顆粒）、基于綠色熒光蛋白的標(biāo)記。在一些情況下，對于氧化還 原標(biāo)記例如二茂鐵，檢測儀可以是氧化還原分子的安培測試的電極。例如，如果氧還標(biāo)記以 二茂鐵的還原形式存在，那么在高電極電勢下的電極可氧化還原形式的二茂鐵，從而將其 轉(zhuǎn)換成二茂鐵的氧化形式。產(chǎn)生的電流與溶液中的二茂鐵標(biāo)記濃度成比例。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施例中，報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸可含有焚光標(biāo)記和淬滅劑，從而使得 酶切的報(bào)道核酸提供熒光信號(hào)，未酶切的報(bào)道核酸不提供熒光信號(hào)。在一些情況下，報(bào)道核 酸或信號(hào)放大核酸可以含有標(biāo)記（例如熒光標(biāo)記或辣根過氧化物酶等酶），并可結(jié)合于固 相載體（例如微量滴定板孔）。例如，報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸可結(jié)合于固相載體，使得擴(kuò) 增性限制性內(nèi)切核酸酶在擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)酶切能夠釋放報(bào)道核酸或信 號(hào)放大核酸中含有標(biāo)記的部分?？墒占玫降幕旌衔铮脴?biāo)記評估報(bào)道核酸或信號(hào)放大核 酸釋放部分的存在與否及其量。例如，報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸釋放的部分如果存在，可從 含有報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸的微量滴定板孔（例如96-孔板）的一個(gè)孔轉(zhuǎn)移到微量滴定 板孔的另一個(gè)孔，在該處評估轉(zhuǎn)移的物質(zhì)來自標(biāo)記的信號(hào)?？蓪⑷魏螖?shù)量的標(biāo)記分子結(jié)合 于一個(gè)報(bào)道核酸分子或一個(gè)信號(hào)放大核酸分子。例如，一個(gè)報(bào)道核酸分子或一個(gè)信號(hào)放大 核酸分子可含有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)焚光分子。
[0073] 可用任何合適的方法將標(biāo)記結(jié)合在報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸的核酸組分上。在一 些情況下，標(biāo)記可通過離子或共價(jià)結(jié)合結(jié)合。例如，可用共價(jià)鍵，例如酰胺鍵、二硫鍵、和硫 醚鍵，或交聯(lián)劑形成的鍵。在一些情況下，可使用非共價(jià)鍵。結(jié)合可以是直接結(jié)合或間接結(jié) 合。例如，可用連接基將標(biāo)記與報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸的核酸組分結(jié)合。在一些情況下， 核酸可包含巰基修飾，標(biāo)記可基于4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯 (SMCC)，使用與他處所述類似的技術(shù)偶聯(lián)于含巰基的核酸（Dill等，生物傳感器和生物電 子學(xué)，20:736-742(2004))。在一些情況下，可將生物素化核酸和含鏈霉親和素的限制性內(nèi) 切核酸酶通過生物素-鏈霉親和素作用互相結(jié)合?？捎美?-(3[2-吡啶基二巰基]-丙 酰胺）己酸磺酸琥珀酯使標(biāo)記與鏈霉親和素偶聯(lián)?？蓪?biāo)記結(jié)合于報(bào)道核酸或信號(hào)放大核 酸的核酸組分的任何位置。例如，標(biāo)記可結(jié)合在報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸的核酸組分的任 何一端（例如5'末端或3'末端），核酸組分的中間，或沿核酸組分長度的任何位置。
[0074] 本文提供的方法和材料可用于檢測任何類型樣品中的目標(biāo)核酸。例如，可收集血 液樣品、血清樣品、唾液樣品、鼻拭子樣品、糞便樣品、尿樣、組織樣（例如組織活檢樣品）、 環(huán)境樣品（例如水樣、土樣和空氣樣品）、食物樣品（例如肉樣、產(chǎn)品樣品或飲料樣）、和工 業(yè)樣品（例如空氣過濾器樣品和從工作站收集到的樣品）并評估目標(biāo)核酸。一旦獲得，可 處理要評估的樣品以獲得目標(biāo)核酸。例如，可在組織樣上進(jìn)行核酸抽提，以獲得富含核酸的 樣品。在一些情況下，可加熱樣品或用細(xì)胞裂解劑處理，以從存在于樣品中的細(xì)胞內(nèi)釋放核 酸。
[0075] -旦獲得，將要評估的樣品與本文所述的探針核酸接觸。該接觸步驟可以在任意 長度的時(shí)間和任何溫度下進(jìn)行以便目標(biāo)核酸與探針核酸雜交。例如，該步驟可以在10秒到 24小時(shí)間（例如30秒到12小時(shí)，30秒到8小時(shí)，30秒到4小時(shí)，30秒到2小時(shí)，30秒到1 小時(shí)，1分鐘到24小時(shí)，1分鐘到12小時(shí)，1分鐘到8小時(shí)，1分鐘到4小時(shí)，1分鐘到2小時(shí)，1 分鐘到1小時(shí)，5分鐘到1小時(shí)，10分鐘到1小時(shí)，15分鐘到1小時(shí)，或30分鐘到1小時(shí)之間） 進(jìn)行。起始溫度可以是15°C到100°C (;例如23°C到98°C，23°C到90°C，23°C到85°C，23°C 到 75 °C，23 °C 到 65 °C，23 °C 到 55 °C，23 °C 到 45 °C，23 °C 到 35 °C，30 °C 到 95 °C，30 °C 到 85°C，30°C 到 75°C，30°C 到 65°C，30°C 到 55°C，30°C 到 45°C，20°C 到 40°C，20°C 到 30°C， 到25°C到35°C)。該接觸步驟中的溫度可以維持穩(wěn)定或可以升高或下降。例如，起始溫度 可以是約40°C -85°C，然后溫度可以在30秒到30分鐘內(nèi)（例如約30秒到15分鐘，約30秒 到10分鐘，約1分鐘到30分鐘，約1分鐘到15分鐘，或約1分鐘到5分鐘）下降到室溫。
[0076] 樣品（例如要測試或懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品）與探針核酸的接觸可以在識(shí)別性 限制性內(nèi)切核酸酶的存在下發(fā)生，或可進(jìn)行單獨(dú)的在反應(yīng)中加入識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶 的步驟。識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶步驟可以在允許識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切目標(biāo)核酸 和探針核酸雜交形成的識(shí)別性限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)的任何時(shí)間和任意溫度下進(jìn)行。 例如，該步驟可以在1秒到24小時(shí)（例如1秒到30分鐘，1秒到1小時(shí)，5秒到1小時(shí)，30 秒到24小時(shí)，30秒到12小時(shí)，30秒到8小時(shí)，30秒到4小時(shí)，30秒到2小時(shí)，30秒到1小 時(shí)，1分鐘到24小時(shí)，1分鐘到12小時(shí)，1分鐘到8小時(shí)，1分鐘到4小時(shí)，1分鐘到2小時(shí)， 1分鐘到1小時(shí)，5分鐘到1小時(shí)，10分鐘到1小時(shí)，15分鐘到1小時(shí)或30分鐘到1小時(shí)） 之間進(jìn)行。溫度可以是15°C到75°C (例如15°C到75°C，15°C到65°C，15°C到55°C，15°C 到 45 °C，15 °C 到 35 °C，15 °C 到 30 °C，23 °C 到 55 °C，23 °C 到 45 °C，30 °C 到 65 °C，30 °C 到 55°C，30°C到45°C，30°C到40°C，35°C到40°C，到36°C到38°C )?？墒褂米R(shí)別性限制性 內(nèi)切核酸酶的任意合適濃度。例如，可使用約〇. 001單位到1000單位（例如約〇. 001單位 到750單位，約0. 001單位到500單位，約0. 001單位到250單位，約0. 001單位到200單 位，約0. 001單位到150單位，約0. 001單位到100單位，約0. 001單位到50單位，約0. 001 單位到25單位，約0. 001單位到10單位，約0. 001單位到1單位，約0. 001單位到0. 1單 位，約0.01單位到1000單位，約0.1單位到1000單位，約1單位到1000單位，約10單位 到1000單位，約50單位到1000單位，約0. 5單位到100單位，或約1單位到100單位）的 限制性內(nèi)切核酸酶?？筛鶕?jù)廠商的說明書使用其它限制性內(nèi)切核酸酶條件，例如鹽濃度。
[0077] 當(dāng)本文所提供的方法中的一個(gè)步驟完成時(shí)，可將得到的含有酶切核酸的反應(yīng)產(chǎn)物 用于下一步。例如，可將反應(yīng)產(chǎn)物的酶切核酸與未酶切核酸分開，用于方法的下一步。例如， 當(dāng)探針核酸結(jié)合于固相載體時(shí)，可收集釋放的含有擴(kuò)增性限制性內(nèi)切核酸酶的探針核酸部 分，如本文所述與報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸接觸。特定步驟得到的反應(yīng)產(chǎn)物可手工或自動(dòng) 化（例如用機(jī)器人）轉(zhuǎn)移到含有下一步的核酸（例如報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸）的位置， 其中核酸可以與固相載體結(jié)合或不結(jié)合。在一些情況下，本文所述的方法的一個(gè)反應(yīng)可以 在微流體裝置或泡罩包裝裝置的一個(gè)位置（例如一個(gè)室）中進(jìn)行，產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物可通過 通道移動(dòng)到含有下一步的核酸（例如報(bào)道核酸或信號(hào)放大核酸）的另一個(gè)位置（例如另一 個(gè)室）。在一些情況下，可通過從反應(yīng)產(chǎn)物中分離未酶切的核酸，在方法的下一步中使用反 應(yīng)產(chǎn)物的經(jīng)酶切核酸。例如，當(dāng)用磁珠作為固相載體時(shí)，可用磁力將磁珠和任何結(jié)合的未酶 切的核酸與反應(yīng)產(chǎn)物分離。
[0078] 可用任何合適的方法檢測經(jīng)酶切的報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大核酸，以測定樣品中 目標(biāo)核酸的存在與否及其量。例如，可用尺寸分選技術(shù)評估反應(yīng)產(chǎn)物中經(jīng)酶切的報(bào)道核酸 和/或信號(hào)放大核酸。這種尺寸分選技術(shù)的例子包括但不限于凝膠電泳和毛細(xì)電泳技術(shù)。 在一些情況下，可進(jìn)行解鏈曲線分析以評估反應(yīng)產(chǎn)物中經(jīng)酶切的報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大 核酸。如本文所述，可用標(biāo)記幫助檢測經(jīng)酶切的核酸（例如報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大核酸）。 可用的標(biāo)記的例子包括但不限于熒光標(biāo)記（使用或不使用淬滅劑）、染料、抗體、放射性物 質(zhì)、酶（例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、漆酶、半乳糖苷酶、或熒光酶）、氧化還原標(biāo)記物 (例如鐵氧還標(biāo)記）、金屬顆粒（例如金納米顆粒）、基于綠色熒光蛋白的標(biāo)記。例如，可用 常規(guī)熒光標(biāo)記檢測儀評估報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大核酸的熒光標(biāo)記部分從固相載體上的 釋放。在一些情況下，經(jīng)酶切的報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大核酸可用電化學(xué)方法檢測。對于電 化學(xué)檢測，報(bào)道核酸和/或信號(hào)放大核酸可包括二茂鐵氧還標(biāo)記。含有二茂鐵的報(bào)道核酸 和/或信號(hào)放大核酸可在過量二茂鐵羧酸存在下，采用碳二亞胺反應(yīng)通過使二茂鐵羧酸與 氨基修飾的寡核苷酸偶聯(lián)獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，對于氧化還原標(biāo)記例如二茂鐵，檢測儀可 以是氧化還原分子的安培測試的電極。例如，如果氧還標(biāo)記以二茂鐵的還原形式存