一種含有藻類的水中“兩蟲(chóng)”的富集、純化方法及其含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種水中檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種含有藻類的水中隱 孢子蟲(chóng)卵囊和賈第鞭毛蟲(chóng)孢囊的富集、純化方法以及其在含藻水中含量的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隱孢子蟲(chóng)和賈第鞭毛蟲(chóng)(簡(jiǎn)稱"兩蟲(chóng)"）是兩種寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的致病性原 生動(dòng)物，近年來(lái)國(guó)外出現(xiàn)了多次由于水中"兩蟲(chóng)"所導(dǎo)致的介水疾病的暴發(fā)，其危害已經(jīng) 引起了廣泛的重視。"兩蟲(chóng)"作為兩種重要的病原微生物已經(jīng)列入《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 (GB5749-2006)，明確規(guī)定其限值〈1個(gè)/10L。
[0003] 由于水中"兩蟲(chóng)"的含量一般較低，現(xiàn)有對(duì)"兩蟲(chóng)"的檢測(cè)通常需要經(jīng)過(guò)濃縮富 集、分離純化及染色和鏡檢多個(gè)檢測(cè)步驟完成。其中最為常用的檢測(cè)方法是采用美國(guó)的 EPA1623方法("EPA1623方法"是由美國(guó)國(guó)家環(huán)保局制定的用于測(cè)定水中隱孢子蟲(chóng)和賈第 鞭毛蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)方法)。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法（GB/T5750. 12-2006)參照美國(guó)環(huán)保局（USEPA) 制定的方法（815-R-05-002)，濾囊/濾芯富集結(jié)合免疫磁分離和免疫熒光染色顯微觀察。 然而由于專用的濾囊/濾芯以及免疫磁珠分離試劑盒，檢測(cè)成本昂貴，并不利于日常檢測(cè) 中的規(guī)模化推廣。
[0004] 日本對(duì)檢測(cè)環(huán)境水樣中的"兩蟲(chóng)"方法進(jìn)行了改進(jìn)，用膜過(guò)濾-丙酮溶解這一操作 步驟優(yōu)替代1623中的濾筒/濾囊過(guò)濾，避免了洗脫過(guò)程中"兩蟲(chóng)"的流失，提高了回收率。 然而在水源水中藻類濃度較高條件下，無(wú)論采用濾囊/濾芯或膜過(guò)濾的方式進(jìn)行濃縮，往 往需要多個(gè)濾囊/濾芯或?yàn)V膜進(jìn)行，不僅操作上麻煩，而且實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)較大；同時(shí)由于得到過(guò) 多的沉淀，不利于隱孢子蟲(chóng)卵囊和賈第鞭毛蟲(chóng)孢囊的進(jìn)一步分離純化，導(dǎo)致回收率不高。但 是，藻類數(shù)量繁多的情況下，特別在夏秋季，有的水源水每毫升藻類數(shù)量可達(dá)千萬(wàn)以上，是 "兩蟲(chóng)"的千萬(wàn)倍，需要通過(guò)多個(gè)濾囊/濾芯或?yàn)V膜才能完成濃縮富集，有些藻類(例如銅綠 微囊藻)和"兩蟲(chóng)"的大小、形狀非常相近，后續(xù)的分離純化難度大，容易導(dǎo)致回收率過(guò)低，甚 至還能自發(fā)熒光，產(chǎn)生藻類掩蔽效應(yīng)，干擾"兩蟲(chóng)"鏡檢，對(duì)"兩蟲(chóng)"含量通常較低的水源水 檢測(cè)造成很大干擾。因此有必要針對(duì)高藻水條件下開(kāi)發(fā)一種操作方便，且成本不高的富集 及分離純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題和不足，提供一種含有藻類的 水中的隱孢子蟲(chóng)卵囊和賈第鞭毛蟲(chóng)孢囊檢測(cè)回收率的富集、分離、純化方法及其含量的檢 測(cè)方法，本發(fā)明方法中"兩蟲(chóng)"的回收率高，背景雜質(zhì)干擾少，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，同時(shí)本發(fā)明不 需要昂貴的儀器設(shè)備、耗材，操作簡(jiǎn)便，達(dá)到了降低測(cè)試成本的目的。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種含有藻類的水中隱孢子蟲(chóng)和賈第鞭 毛蟲(chóng)的富集、純化方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟：
[0007] I)加壓處理
[0008] 對(duì)含有藻類的水進(jìn)行加壓處理，然后靜置放置，獲得上清液；
[0009] 2)濃縮、富集處理
[0010] 首先，采用醋酸纖維濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾；接著將過(guò)濾后醋酸纖維濾膜和濾膜 截留物加入到丙酮中，溶解、分散，獲得丙酮溶解-分散混合物；然后對(duì)丙酮溶解-分散混合 物進(jìn)行離心處理，收集沉淀，獲得"兩蟲(chóng)"富集沉淀；
[0011] 3)分離、純化處理
[0012] 向"兩蟲(chóng)"富集沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成"兩蟲(chóng)"懸浮液，接 著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質(zhì)，然后進(jìn)行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層， 取中間層，即得純化的隱孢子蟲(chóng)和賈第鞭毛蟲(chóng)。
[0013] 其中，步驟1)中所述含藻水中藻類的濃度< IX IO8個(gè)藻類細(xì)胞/升，即每IL含 藻水中含有的藻類細(xì)胞的個(gè)數(shù)< IXIO8個(gè)藻類細(xì)胞。
[0014] 特別是，所述含藻水中藻類的濃度優(yōu)選為5X IO7~I X IO8個(gè)藻類細(xì)胞/升，即每 IL含藻水中含有5X IO7~IX IO8個(gè)藻類細(xì)胞。
[0015] 特別是，所述藻類為微囊藻。
[0016] 尤其是，所述藻類為銅綠微囊藻。
[0017] 其中，步驟1)中所述加壓處理過(guò)程中相對(duì)壓力為0· 7-1. OMPa，優(yōu)選為 0. 8-0. 9MPa ;加壓處理時(shí)間為5-20min，優(yōu)選為5-15min，進(jìn)一步優(yōu)選為lOmin。
[0018] 特別是，所述靜置放置處理的時(shí)間彡lOmin，優(yōu)選為10-20min。
[0019] 特別是，將含有藻類的水放置于耐壓容器內(nèi)，進(jìn)行所述的加壓處理。
[0020] 尤其是，所述的耐壓容器選擇加壓釜。
[0021] 其中，步驟2)中所述離心處理包括如下處理步驟：
[0022] 2A)將丙酮溶解-分散混合物進(jìn)行離心處理，去除上清液，獲得丙酮溶解-分散混 合物離心沉淀物；
[0023] 2B)向丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物中加入乙醇和PBS緩沖溶液，混合后獲得 乙醇-PBS緩沖混合液，對(duì)乙醇-PBS緩沖混合液進(jìn)行離心處理，去除上清液，獲得"兩蟲(chóng)"富 集沉淀。
[0024] 特別是，還包括步驟2A-1)，將步驟2A)離心處理后的上清液加入到水中，產(chǎn)生白 色絮體，則繼續(xù)向離心沉淀物中加入丙酮，溶解，混合均勻后再進(jìn)行離心處理，直至離心處 理后的上清液加入到水中無(wú)白色絮體形成為止。
[0025] 特別是，步驟2B)中丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物與乙醇的體積之比為 1:5-15,優(yōu)選為1:9-10,進(jìn)一步優(yōu)選為1:10 ;丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物與PBS緩沖 溶液的體積之比為1 :50-75,優(yōu)選為1 :62-69。
[0026] 尤其是，所述乙醇選擇質(zhì)量百分比濃度為75%_95%的乙醇。
[0027] 尤其是，步驟2B)中所述PBS緩沖溶液(磷酸緩沖溶液）按照如下步驟制備而成：
[0028] 2B-1)按照如下用量備料（以IL水量計(jì)）
[0029] NaCl 8.0 g Να,ΗΡ〇Γ?2Η；>0 2.9 g KCI 0.2 g KH2PO4 0.2 g
[0030] 2Β-2)將上述原料加入純水中，攪拌溶解均勻后定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH到 7. 2-7. 4,制得磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖溶液)。
[0031] 特別是，步驟2)中所述離心處理過(guò)程中保持溫度為15-25°C，優(yōu)選為20°C。
[0032] 尤其是，離心處理過(guò)程中離心力為1000_2000g，優(yōu)選為1050g。
[0033] 其中，步驟3)中所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液按照如下步驟制備而成：
[0034] 3A)按照如下用量備料（以IL水量計(jì)）
[0035] NaCl 8,0 g Na-HjjOi 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g
[0036] 3B)將上述原料加入到純水中，攪拌溶解均勻后定容至1000 mL,調(diào)節(jié)pH到 7. 2-7. 4,制得磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖溶液）；
[0037] 3C)向磷酸鹽緩沖溶液中加入吐溫80,攪拌混勻，即得，其中每IOOmL磷酸鹽緩沖 溶液中加入〇. 1-0. 2mL的吐溫80。
[0038] 特別是，步驟3C)中每IOOmL磷酸鹽緩沖溶液中加入0.1 mL的吐溫80。
[0039] 其中，步驟3)中所述"兩蟲(chóng)"富集沉淀與所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液的體積之比 為1:10-30,優(yōu)選為1:12-20,進(jìn)一步優(yōu)選為1:20。
[0040] 特別是，還包括將所述"兩蟲(chóng)"富集沉淀和所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液的混合物進(jìn) 行攪拌均勻或置于渦旋震蕩混合器中，振蕩混合2-5min，制成混合均勻的"兩蟲(chóng)"懸浮液（即 隱孢子蟲(chóng)和賈第鞭毛蟲(chóng)懸浮液)。
[0041] 其中，步驟3)中所述Percoll-鹿糖介質(zhì)的密度為1. 10-1. 15g/cm3,優(yōu)選為I. 12g/ cm3。
[0042] 特別是，每100ml所述Percoll-鹿糖介質(zhì)含有45mL Percoll液，8. 55g鹿糖和余 量的水。
[0043] 尤其是，所述Percoll-鹿糖介質(zhì)按照如下步驟制備而成：將45mL Percoll液， 8. 55g蔗糖，溶解定容到IOOmL純水中，混勻。
[0044] 特別是，所述Percoll-蔗糖介質(zhì)與所述"兩蟲(chóng)"懸浮液的體積之比為1:1-2. 5,優(yōu) 選為1:2。
[0045] 尤其是，所述Percoll-蔗糖介質(zhì)從所述"兩蟲(chóng)"懸浮液的底部加入后，再進(jìn)行所述 的離心處理。
[0046] 其中，步驟3)中所述離心處理過(guò)程中離心力為1000_2000g，優(yōu)選為1050g。
[0047] 特別是，離心處理過(guò)