度為30%、70%、90%的甘油-乙醇溶液進(jìn)行所述脫水處理時(shí)的用量均為1. 0-1. 5mL，優(yōu)選為 I. 2mL〇
[0105] 特別是，還包括用PBS緩沖溶液淋洗附著有"兩蟲"的濾膜，并抽濾去除PBS緩沖 溶液后在進(jìn)行所述的固定處理。
[0106] 尤其是，染色處理過程中，滴加單克隆抗體免疫熒光染色試劑后將附著有"兩蟲" 的濾膜在暗盒中靜置20min后在滴加 DAPI染色液。
[0107] 特別是，滴加 DAPI溶液后靜置時(shí)間為lOmin。
[0108] 其中，所述抗熒光衰退封片劑按照如下方法制備而成：稱取12. 6g甘油，接著將甘 油加熱至60-70°C，然后加入0. 2g DABCO (1，4-二偶氮雙環(huán)[2, 2, 2]辛烷)攪拌至溶解，即 得。
[0109] 特別是，步驟4c)中所述磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖溶液)按照如下步驟制備而成： [0110] 4c_l)按照如下用量備料（以IL水量計(jì)）
[0111] NaCl 8.0 g Na2HPO4 ? IlH2O 2,9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g
[0112] 4c_2)將上述原料加入到純水中，攪拌溶解均勻后定容至1000 mL,調(diào)節(jié)pH到 7. 2-7. 4,即得。
[0113] 本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0114] 1、本發(fā)明方法利用對(duì)含藻水進(jìn)行加壓處理，使得懸浮于水中的藻類密度增大而沉 淀，與懸浮于水中的"兩蟲"分離，進(jìn)而濃縮、富集水中的"兩蟲"，提高了 "兩蟲"檢查結(jié)果的 準(zhǔn)確性。
[0115] 2、本發(fā)明方法將沉淀的藻類靜置，過濾后，獲得提純、富集、濃縮的隱孢子蟲卵囊 和賈第鞭毛蟲孢囊（即"兩蟲")，然后對(duì)富集的"兩蟲"通過密度梯度離心的方式進(jìn)行純化， 減少了顯微鏡觀察時(shí)的背景雜質(zhì)干擾，提高了檢測方法的準(zhǔn)確性。
[0116] 3、本發(fā)明方法中通過加壓處理破壞與"兩蟲"密度相近、易干擾"兩蟲"染色鏡檢 效果的銅綠微囊藻，致使藻細(xì)胞密度增加而沉淀，得以去除，提高后續(xù)分離純化效率，從而 有效地解決了高藻干擾條件下傳統(tǒng)隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊檢測方法回收率不高、 易受密度類似藻類干擾的問題，同時(shí)也避免了與"兩蟲"形態(tài)類似的、且可以自發(fā)熒光的藻 類干擾，提高了鏡檢結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0117] 4、本發(fā)明檢測高含藻水樣中"兩蟲"含量的方法的回收率高，符合美國國家環(huán)保局 制定的用于測定水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法，即EPA1623方法的要求，達(dá)到規(guī) 定的標(biāo)準(zhǔn)。
[0118] 5、本發(fā)明方法使用的設(shè)備和原料價(jià)格低廉，有效地降低了水中"兩蟲"檢測的成 本，測定方法操作簡便，利于廣泛推廣使用。
【具體實(shí)施方式】：
[0119] 以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0120] 實(shí)施例1配制緩沖溶液
[0121] 1、磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液）的配制：
[0122] 1)按照如下用量備料（以IL水量計(jì)）
[0123] NaCI (分折純） 8.0 g Na2HPO4 · 12H:0 (分tli.純） 2,9 g KCl (分析純） 0.2 g KH2PO4 (分柝純） 0.2 g
[0124] 2)將上述成分原料加入到純水中，攪拌溶解均勻后定容至1000 mL,調(diào)節(jié)pH到 7. 2-7. 4,即得。
[0125] 2、磷酸鹽-吐溫緩沖溶液（PBST溶液）的配制
[0126] 向上述制備的PBS溶液中加入吐溫80,攪拌混勻，即得，其中每IOOmL的PBS溶液 中加入0.01-0. 2mL吐溫80。
[0127] 本發(fā)明實(shí)施例中選用每IOOmL的PBS溶液中加入0.1 mL吐溫80。
[0128] 3、Percoll-蔗糖溶液分離介質(zhì)的配制
[0129] 將45mL Percoll液，8. 55g蔗糖，溶解定容到IOOmL純水中混勻，即得。
[0130] 密度為I. 10-1. 15g/cm3的Percoll-鹿糖溶液均適用于本發(fā)明。
[0131] 4、抗熒光衰退封片劑配制
[0132] 用一次性滴管稱取甘油12. 6g，接著將稱好的甘油放到加熱攪拌器加熱至 60-70°C，然后加入0.2g DABCO (1，4_二偶氮雙環(huán)[2, 2, 2]辛烷，美國Waterborne公司）到 甘油中攪拌至溶解，即得。
[0133] 實(shí)施例2
[0134] 1)配制含"兩蟲"的含藻水
[0135] 選取藍(lán)藻"水華"中常見的銅綠微囊藻為代表，配置藻類濃度為5X IO7~IXlO8 個(gè)cells/L的水樣（即每IL水樣中含有5X IO7~IX IO8個(gè)藻類細(xì)胞)。
[0136] 首先，向IOL去離子水中加入銅綠微囊藻，攪拌均勻，配制成藻類濃度為5 X IO7個(gè) 藻類細(xì)胞/升的高含藻水；
[0137] 然后，向高含藻水中投加"兩蟲"（即隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊）標(biāo)樣各500 個(gè)，使得每IL含藻水中含隱孢子蟲卵囊、賈第鞭毛蟲孢囊各50個(gè)，制得含"兩蟲"的含藻水。
[0138] 2)加壓處理含藻水
[0139] 首先，將IOL含有"兩蟲"的含藻水放置于加壓釜(北京盛方鑫達(dá)不銹鋼有限公司） 中，開啟電源，向加壓釜內(nèi)進(jìn)行加壓，使得加壓釜內(nèi)的相對(duì)壓力達(dá)到〇. SMPa ;接著在相對(duì)壓 力為0. SMPa的條件下，保持IOmin ;然后卸除壓力，在常壓下靜置放置IOmin后過濾，獲得 第一上清液。
[0140] 本發(fā)明中加壓處理過程中相對(duì)壓力為0. 7-1. OMPa，加壓處理時(shí)間為10-20min均 適用于本發(fā)明，本發(fā)明實(shí)施例中選用相對(duì)壓力為〇. 8MPa、加壓處理時(shí)間為IOmin為例進(jìn)行 說明。
[0141] 對(duì)加壓釜內(nèi)的含藻水進(jìn)行加壓處理，使水中藻類細(xì)胞中氣囊破裂，改變?cè)寮?xì)胞體 積，從而使得懸浮于水中的藻類密度增大而沉淀，去除靜置放置后的含藻沉淀，實(shí)現(xiàn)大部分 藻類與水中的"兩蟲"分離。
[0142] 3)濃縮、富集處理
[0143] 3-1)過濾
[0144] 將全部的第一上清液用醋酸纖維濾膜進(jìn)行過濾，醋酸纖維濾膜將"兩蟲"截留在濾 膜表面，；
[0145] 3-2)丙酮溶解
[0146] 將表面截留有"兩蟲"的醋酸纖維濾膜移入到50mL離心管中，加入丙酮定容至 40mL，晃動(dòng)離心管直至濾膜溶解，"兩蟲"分散到丙酮中，獲得丙酮溶解-分散混合物。
[0147] 3-3)丙酮溶解-分散混合物離心處理
[0148] 對(duì)丙酮溶解-分散混合物進(jìn)行丙酮溶解混合物的離心處理（1050g、20°C下離心 lOmin)，取一滴上清液于水中，如有白色絮體形成(表明還有醋酸纖維濾膜未溶解完全)，用 吸管吸掉上層離心液，獲得丙酮溶解-分散混合物第一次離心沉淀物；
[0149] 繼續(xù)向離心管中添加丙酮至40mL，晃動(dòng)溶解，進(jìn)行第二次丙酮溶解-分散混合物 的離心處理（1050g、20°C下離心10min)，取一滴上清液于水中，如有白色絮體形成，吸掉上 層離心液，繼續(xù)添加丙酮，進(jìn)行丙酮溶解-分散混合物的離心處理，直至離心后的上清液滴 加到水中不產(chǎn)生白色絮體為止，吸掉上層離心液，獲得丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物 (0.5ml);
[0150] 3-4)乙醇-PBS緩沖溶液離心處理
[0151] 向含有丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物的離心管中添加5mL乙醇(質(zhì)量百分 比濃度為95%，本發(fā)明實(shí)施例中選用質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇，其他質(zhì)量百分比濃度 為75%-95%的乙醇均適用于本發(fā)明），輕輕混勻后再緩慢加入PBS緩沖溶液直至40mL，再 在1050g、20°C條件下離心10min，離心完成后去除上清液，獲得"兩蟲"富集沉淀（0. 5ml)， 其中，離心沉淀物與乙醇的體積之比為I :1〇 ;離心沉淀物與PBS緩沖溶液的體積之比為1 : 69 〇
[0152] 向表面截留有"兩蟲"的醋酸纖維濾膜中加入丙酮，晃動(dòng)直至醋酸纖維濾膜溶解， "兩蟲"分散到丙酮中，然后進(jìn)行離心處理，使得"兩蟲"與醋酸纖維濾膜分離。由于丙酮為 非極性溶液，分散并懸浮于丙酮溶液中的"兩蟲"已被脫水而且細(xì)胞壁呈非極性狀態(tài)，后續(xù) 分離、純化處理和鏡檢處理過程中均是將"兩蟲"分散于水性的緩沖溶液中，如果將脫水后 細(xì)胞壁呈非極性的"兩蟲"直接進(jìn)行后續(xù)處理，將會(huì)導(dǎo)致"兩蟲"細(xì)胞壁的破裂或變形，不利 于鏡檢過程中"兩蟲"的辨認(rèn)。為了保持"兩蟲"在鏡檢過程中細(xì)胞的完整形態(tài)，在丙酮溶 解-分散混合物離心處理后加入質(zhì)量百分比濃度為75%-95%乙醇、PBS緩沖溶液對(duì)"兩蟲" 細(xì)胞外壁進(jìn)行極性調(diào)整，以保持"兩蟲"的細(xì)胞形態(tài)完整，從而保障后續(xù)染色鏡檢步驟的順 利完成。
[0153] 4)分離、純化處理