[0154] 向"兩蟲"富集沉淀中加入6mL PBS+O. l%Tween80 (PBST溶液與"兩蟲"富集沉淀 的體積之比為12:1)，置于渦旋震蕩混合器(英國STUART公司）振蕩2min，使沉淀均勻懸浮 在PBST溶液中，制得沉淀懸浮液；
[0155] 將所得沉淀懸浮液平均分裝到4個15mL的離心管中，按照體積比為1:2的比例， 從離心管底部緩慢注入密度為I. 12g/cm3的Percoll-蔗糖溶液(使密度為I. 12g/cm3的 Percoll-蔗糖溶液位于沉淀懸浮液的下部)，然后在1050g，20°C下進行第一次密度梯度離 心lOmin，由于密度的差異，溶液分成三層，其中隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊會富集在 中間層溶液，小心取出，即可獲得純化的隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊純化液，即第一 "兩蟲"純化液，裝入新的50mL離心管內(nèi)。
[0156] 向第一次密度梯度離心后的沉淀中加入PBST緩沖溶液，混勻制得沉淀懸浮液，然 后再加入比重為1. 12的Percoll-蔗糖溶液，第一次密度梯度離心后的沉淀與Percoll-蔗 糖溶液的體積之比為1:2,然后在1050g，20°C下進行第二次密度梯度離心10min，溶液分成 三層，取中間離心層，將得到中間層與第一 "兩蟲"純化液混合，得到純化的"兩蟲"液。
[0157] 5)染色、鏡檢
[0158] 首先，對"兩蟲"純化液進行抽濾，其中，抽濾的濾膜為孔徑為3μπι的醋酸纖維膜 (CA膜)，抽濾過程中絕對壓力為0-5mmHg (本發(fā)明抽濾時的絕對壓力為2mmHg)，"兩蟲"附 著在孔徑為3 μ m的醋酸纖維I旲上；
[0159] 接著，用2_3111^^5淋洗，抽濾，然后加入50(^1^0.1%854(牛血清白蛋白)溶液，靜置 2min，進行固定處理，隨后抽吸掉多余的BSA溶液，將醋酸纖維膜平移到載玻片上，再滴加 一滴單克隆抗體免疫熒光染色試劑(美國Waterborne公司），在密閉的暗盒中靜置20min， 再加入4 μ g/mL的DAPI溶液100 μ L，再靜置IOmin，進行染色處理；
[0160] 然后，抽濾去除多余的單克隆抗體熒光染色液，接著用2_3mL PBS溶液淋洗，再依 次滴加體積百分比濃度為30%、70%、90%的甘油-乙醇溶液，對濾膜進行脫水處理，其中體 積百分比濃度為30%、70%、90%的甘油-乙醇溶液的用量均為1. 0-1. 5mL，（本發(fā)明的用量為 I. 2mL)；
[0161] 最后，將脫水處理后的醋酸纖維膜平移至事先滴有抗熒光衰退封片劑的載玻片 上，接著在醋酸纖維膜的上方滴加一滴抗熒光衰退封片劑，封片，置于奧林巴斯電動顯微鏡 (型號BX51，日本奧林巴斯）下，進行鏡檢計數(shù)，其中：
[0162] 先用400倍條件下，用藍(lán)色濾光片（激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長510nm)檢測異硫氰 酸熒光素單抗標(biāo)記的卵囊或孢囊，用紫外光濾光片（激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長420nm)檢測 DAPI染色條件下"兩蟲"的藍(lán)色細(xì)胞核；1000倍條件下，利用DIC模式觀察"兩蟲"內(nèi)部形 態(tài)結(jié)構(gòu)，其中呈橢圓形，大小為（8~15) μ mX (5~8) μ m，囊壁與蟲體間有明顯空隙，或者 孢囊中含有2-4個核，多偏于一端，確認(rèn)為賈第鞭毛蟲孢囊；圓形或橢圓形，直徑2~6 μ m， 或者內(nèi)部可見殘留體及子孢子，確認(rèn)為隱孢子蟲卵囊。
[0163] 鏡檢的檢測結(jié)果如表1所示，測定結(jié)果回收率如表2所示。
[0164] 回收率（R)計算公式：R=N/T，
[0165] 其中：R :回收率；N :檢測到的賈第鞭毛蟲孢囊、隱孢子蟲卵囊數(shù)目；T :加標(biāo)數(shù)目；
[0166] 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算：
[0167] RSD=Y/X
[0168] Y2= Σ (Xi-X) 2/(N-I)
[0169] X= Σ Xi/N
[0170] 其中：RSD :相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；Xi :每次加標(biāo)回收的個數(shù)；N :檢測的次數(shù)；
[0171] 表1高含藻水中"兩蟲"檢測結(jié)果
[0172]
【主權(quán)項】
1. 一種含有藻類的水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的富集、純化方法，包括如下順序進行 的步驟： 1) 加壓處理 對含有藻類的水進行加壓處理，然后靜置放置，獲得上清液； 2) 濃縮、富集處理 首先，采用醋酸纖維濾膜對上清液進行過濾；接著將過濾后醋酸纖維濾膜和濾膜截留 物加入到丙酮中，溶解、分散，獲得丙酮溶解-分散混合物；然后對丙酮溶解-分散混合物進 行離心處理，收集沉淀，獲得"兩蟲"富集沉淀； 3) 分離、純化處理 向"兩蟲"富集沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成"兩蟲"懸浮液，接著向懸 浮液中加入Percoll-蔗糖介質(zhì)，進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層， 即得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：步驟1)中所述含有藻類的水中藻類的濃度 彡IX IO8個藻類細(xì)胞/升。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，步驟1)中所述加壓處理過程中相對壓力 為 0· 7-1. OMPa。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，步驟2)中所述離心處理包括如下處理步 驟： 2A)將丙酮溶解-分散混合物進行離心處理，去除上清液，獲得丙酮溶解-分散混合物 離心沉淀物； 2B)向丙酮溶解-分散混合物離心沉淀物中加入乙醇和PBS緩沖溶液，混合后獲得乙 醇-PBS緩沖混合液，對乙醇-PBS緩沖混合液進行離心處理，去除上清液，獲得"兩蟲"富集 沉淀。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3)中所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液按 照如下步驟制備而成： A) 按照如下用量備料（以IL水量計） NaCl 8,0 g Na2HPO4 · 12H20 2.9 g κα 02 g KH2PO4 0.2 g B) 將上述原料加入到純水中，攪拌溶解均勻后定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH到7. 2-7. 4,制得 磷酸鹽緩沖溶液； C) 向磷酸鹽緩沖溶液中加入吐溫80,攪拌混勻，即得，其中每IOOmL磷酸鹽緩沖溶液中 加入0.01-0. 2mL的吐溫80。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3)中所述"兩蟲"富集沉淀與所述磷 酸鹽-吐溫緩沖溶液的體積之比為1:10-30。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3)中所述Percoll-鹿糖介質(zhì)的密 度為 I. 1CK1. 15g/cm3。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是：步驟3)中加入的Percoll-鹿糖介質(zhì)與 所述"兩蟲"懸浮液的體積之比為1:1-2. 5。
9. 一種含有藻類的水中"兩蟲"含量的測定方法，包括如下順序進行的步驟： 1) 加壓處理 對含有藻類的水加壓后靜置，獲得上清液； 2) 濃縮、富集處理 首先，采用醋酸纖維濾膜對上清液進行過濾；接著將過濾后醋酸纖維濾膜和濾膜截留 物加入到丙酮中，溶解，分散，獲得丙酮溶解-分散混合物；然后對丙酮溶解-分散混合物進 行離心處理，收集沉淀，獲得"兩蟲"富集沉淀； 3) 分離、純化處理 向"兩蟲"富集沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成"兩蟲"懸浮液，接著向 懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質(zhì)，然后進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中 間層，即得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲液； 4) 染色、鏡檢 首先，對"兩蟲"純化液進行過濾處理，接著進行染色處理，然后置于顯微鏡下觀察，鏡 檢計數(shù)。
10. 如權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征是：步驟1)中所述含有藻類的水中藻類的 濃度< IX IO8個藻類細(xì)胞/升。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有藻類的水中“兩蟲”的富集、純化方法及其含量的測定方法。本發(fā)明的富集、純化方法包括首先對含藻水進行加壓處理，沉淀去除藻類，再對上清液進行混合醋酸纖維濾膜過濾，丙酮溶解富集產(chǎn)物，離心后獲得含有“兩蟲”的富集沉淀物，接著向沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液制成“兩蟲”懸浮液，然后進行密度梯度離心處理得到“兩蟲”純化液，最后將“兩蟲”通過過濾附著在醋酸纖維膜上，染色處理后進行熒光顯微鏡檢測，計數(shù)。本發(fā)明方法對含藻水樣中“兩蟲”的濃縮和分離純化方法進行改進，減小了鏡檢時背景雜質(zhì)的干擾，檢測方法的回收率高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，符合美國國家環(huán)保局制定的用于測定水中“兩蟲”的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
【IPC分類】C12R1-90, C12N1-10, C12Q1-06
【公開號】CN104726337
【申請?zhí)枴緾N201310713298
【發(fā)明人】李紅巖, 于建偉, 魏魏, 安偉, 楊敏
【申請人】中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年12月20日