一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥物領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚 體-海兔毒素偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤壞死因子（TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)TNF家族的凋亡因子， 為一種抗癌應(yīng)用前景良好的生物藥物。
[0003] TRAIL在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，并且 位于細(xì)胞膜中，可經(jīng)半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通過與與其細(xì)胞膜受體結(jié) 合發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用的。目前已發(fā)現(xiàn)5種TRAIL受體，包括：TRAIL-R1 (DR4, TNFSFlOa)和 TRAIL-R2(DR5, TNFRSFlOb) ;TRAIL-R3(DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4(DcR2, TNFRSFlOd); 循環(huán)骨保護(hù)素（〇PG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡結(jié)構(gòu)域（DD)，是TRAIL結(jié)合受 體后誘導(dǎo)凋亡所必需的。其余三個(gè)受體由于缺乏功能性死亡結(jié)構(gòu)域，雖然能與TRAIL結(jié)合， 但無法誘導(dǎo)凋亡。
[0004] TRAIL與DR4或DR5結(jié)合后可激活線粒體依賴和非線粒體依賴兩條細(xì)胞凋亡信號 途徑，介導(dǎo)死亡信號傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)效應(yīng)物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最終引起腫瘤 細(xì)胞凋亡。
[0005] 近年來，人們發(fā)現(xiàn)重組可溶TRAIL誘導(dǎo)了廣譜的人腫瘤細(xì)胞系凋亡，但同時(shí)也存 在一些對TRAIL敏感性較低或耐受的腫瘤細(xì)胞，如所有的人黑色素瘤細(xì)胞系、大部分乳腺 癌細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系LNcaP等，這些細(xì)胞表面雖然或多或少也表達(dá)DR4或DR5,卻由 于細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中關(guān)鍵酶的缺失、突變和其他抑制凋亡的蛋白高表達(dá)等原因，導(dǎo)致TRAIL 結(jié)合DR4或DR5之后并不能引起細(xì)胞的最終凋亡。
[0006] 研宄發(fā)現(xiàn)，可溶型重組TRAIL(rTRAIL)與放化療聯(lián)合應(yīng)用能提高腫瘤細(xì)胞對 rTRAIL的敏感性，二者具有協(xié)同作用。目前國際通用的rTRAIL是95~281位氨基酸片段， rTRAIL單體傾向于形成生物活性較好的三聚體而存在，在三聚體的頂部有一個(gè)鋅離子結(jié)合 位點(diǎn)，對穩(wěn)定三聚體構(gòu)象起重要作用。
[0007] 如授權(quán)公告號為CN 102936281 B的中國專利文獻(xiàn)公開了一種rTRAIL突變體及其 海兔毒素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物rTRAIL突變體與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體特異結(jié)合，將MMAE定 向轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放發(fā)揮作用，既可殺傷對TRAIL敏感性低甚至抵抗 的腫瘤細(xì)胞，也減少M(fèi)MAE單獨(dú)給藥產(chǎn)生的毒副作用。
[0008] 該偶聯(lián)物的不足之處在于，rTRAIL本身的半衰期非常短，在嚙齒類動(dòng)物中的半衰 期僅為3到5分鐘且在非人類的靈長類動(dòng)物中的半衰期為23到30分鐘。rTRAIL與海兔 毒素偶聯(lián)后，因產(chǎn)物的分子量增加有限（1316Da)，很難改進(jìn)rTRAIL半衰期短的缺點(diǎn)。針對 rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物半衰期短的缺點(diǎn)，亟需進(jìn)一步的改造以改善其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，提高偶 聯(lián)物的成藥性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物 不僅具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，還具有較長的半衰期。
[0010] 一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，rTRAIL突變體的氨基酸 序列如SEQ ID No. 1所示，所述rTRAIL突變體三聚體上偶聯(lián)有單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞 胺以及帶連接臂的海兔毒素。
[0011] 單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺使得本發(fā)明偶聯(lián)物具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如 更長的半衰期，更高的生物利用度；而海兔毒素則使得本發(fā)明偶聯(lián)物有更強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì) 胞的能力。并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明偶聯(lián)物比rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物（授權(quán) 公告號為CN 102936281 B)具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，比rTRAIL突變體-單甲基化聚 乙二醇馬來酰亞胺偶聯(lián)物（授權(quán)公告號為CN 103408654 B)具有更長的半衰期。表明在本 發(fā)明偶聯(lián)物中，單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、rTRAIL突變體三聚體、海兔毒素并非是單獨(dú) 發(fā)揮各自作用的，三者之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的協(xié)同作用。
[0012] 與授權(quán)公告號為CN 102936281 B、CN 103408654 B的中國發(fā)明專利相同，本發(fā) 明的rTRAIL突變體取自全長TRAIL蛋白的第95~281個(gè)氨基酸，且第109位的天冬酰胺 (Asn)突變?yōu)榘腚装彼幔–ys)。
[0013] 在rTRAIL突變體三聚體中，三個(gè)半胱氨酸殘基的巰基均呈游離態(tài)，用于偶聯(lián)單甲 氧基聚乙二醇馬來酰亞胺或帶連接臂的海兔毒素，偶聯(lián)后，每個(gè)三聚體可以結(jié)合1-2個(gè)PEG 分子和1-2個(gè)MMAE分子，因此本發(fā)明偶聯(lián)物中，rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇 馬來酰亞胺、帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為I: (1~2) : (2~1)。在不同的摩爾比下，偶 聯(lián)物的腫瘤細(xì)胞殺傷能力或半衰期會(huì)有所不同。
[0014] 其中，當(dāng)rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、帶連接臂的海兔 毒素的摩爾比1:2:1時(shí)，偶聯(lián)物的半衰期為最長；而當(dāng)三者的摩爾比為1:1:2時(shí)，偶聯(lián)物的 抗腫瘤活性最強(qiáng)。
[0015] 綜合考慮半衰期和抗腫瘤活性這兩個(gè)指標(biāo)，作為優(yōu)選，本發(fā)明偶聯(lián)物中，rTRAIL 突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為1:1:2或 1:1:1 ;更優(yōu)選為1:1:2。
[0016] 作為優(yōu)選，所述單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為3000~15000Da。作為 優(yōu)選，所述連接臂為馬來酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽。單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞 胺以及上述連接臂均通過馬來酰亞胺基團(tuán)與rTRAIL突變體上的疏基反應(yīng)形成硫醚鍵而實(shí) 現(xiàn)偶聯(lián)。
[0017] 所述連接臂的合成方法、帶連接臂的海兔毒素的合成方法參見授權(quán)公告號為CN 102936281 B的中國發(fā)明專利記載的相關(guān)內(nèi)容。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物的制備方 法，包括以下步驟：
[0019] (1)將rTRAIL突變體多聚體解聚，重新聚合得到rTRAIL突變體三聚體；
[0020] 具體為：將rTRAIL突變體溶于含鋅離子的緩沖液中，加入磷酸三（β -氯乙基） 酯，30~40°C水浴反應(yīng)0. 5h~3h。
[0021] rTRAIL突變體的制備過程參見授權(quán)公告號為CN 102936281 B的中國發(fā)明專利。 rTRAIL突變體（單體）上存在較多的游離巰基，因此單體之間會(huì)通過二硫鍵形成多聚體，但 該多聚體結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的，磷酸三（β-氯乙基）酯（TCEP)可以使不穩(wěn)定的多聚體解聚，保 持單體狀態(tài)，反應(yīng)體系中的鋅離子進(jìn)一步促使rTRAIL突變體單體形成穩(wěn)定的三聚體，在穩(wěn) 定的rTRAIL突變體三聚體中，突變獲得的109位半胱氨酸巰基將游離出來。
[0022] (2)將rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺混合反應(yīng)，得到聚乙 二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物；
[0023] 作為優(yōu)選，rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的摩爾比為 I: L 5~8,反應(yīng)溫度20~30°C，反應(yīng)時(shí)間30s~lh。
[0024] (3)將聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素混合反應(yīng)， 得到所述聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物。
[0025] 作為優(yōu)選，聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素的摩爾 比為1:2~10,反應(yīng)溫度20~30°C，反應(yīng)時(shí)間30~60min。
[0026] 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rTRAIL突變體三聚體先與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯(lián)再與 帶連接臂的海兔毒素偶聯(lián)時(shí)，可以得到目標(biāo)偶聯(lián)物；而當(dāng)TRAIL突變體三聚體先與帶連接 臂的海兔毒素偶聯(lián)再與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯(lián)時(shí)，卻無法得到目標(biāo)偶聯(lián)物。這 是因?yàn)閞TRAIL突變體三聚體上的三個(gè)游離疏基之間存在空間位阻效應(yīng)，而單甲氧基聚乙 二醇馬來酰亞胺的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于帶連接臂的海兔毒素，當(dāng)先偶聯(lián)單甲氧基聚乙二醇馬來 酰亞胺時(shí)，即便單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺過量加入也難以占據(jù)所有反應(yīng)空間，總會(huì)為 帶連接臂的海兔毒素留下一定的反應(yīng)空間；而若先偶聯(lián)帶連接臂的海兔毒素，帶連接臂的 海兔毒素會(huì)占據(jù)所有反應(yīng)空間，而無法進(jìn)一步偶聯(lián)單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺。
[0027] 不僅如此，將rTRAIL突變體三聚體先與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺還有利于 提高rTRAIL突變體三聚體的水溶性，顯著減少下一步與帶連接臂的海兔毒素偶聯(lián)所導(dǎo)致 的沉淀，因此從得率上來說也優(yōu)于rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物。本發(fā)明偶聯(lián)物水溶液具有比單純 的rTRAIL分子或rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物更佳的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為經(jīng)反復(fù)凍融后不出現(xiàn)沉淀。
[0028] 因此，通過調(diào)節(jié)單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、帶連接臂的海兔毒素的加入量，可 以調(diào)整rTRAIL突變體三聚體上偶聯(lián)的PEG/MMAE (聚乙二醇/海兔毒素）比值。
[0029] 當(dāng)rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的摩爾比為1:1.5~ 2時(shí)、聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為1:4~ 10時(shí)，可得到rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、海兔毒素的摩爾比為 1:1:2的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物；
[0030] 當(dāng)rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的摩爾比為1:2~4,聚 乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為1:2~8時(shí)，可得 到rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、海兔毒素的摩爾比為1:1:1的聚 乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒