素偶聯(lián)物；
[0031] 當(dāng)rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的摩爾比為1:4~8、聚 乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為1:2~6時，可得 到rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、海兔毒素的摩爾比為1:2:1的聚 乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物。
[0032] 本發(fā)明還提供了所述聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物在制備抗 腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0033] 所述抗腫瘤藥物用于誘導(dǎo)細胞表面表達有死亡受體的腫瘤細胞凋亡。作為優(yōu)選， 所述抗腫瘤藥物為抗結(jié)腸癌藥物、抗血癌藥物、抗卵巢癌藥物、抗胃癌藥物、抗肺癌藥物、抗 乳腺癌藥物或抗肝癌藥物。
[0034] 所述抗腫瘤藥物包括有效量的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián) 物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。制備時，通常將活性成分與賦形 劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作 用時，它可采用固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物 可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。
[0035] 合適的賦形劑包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙 烯吡咯烷酮、纖維素、水等；制劑還可包括：濕潤劑、乳化劑、防腐劑（如羥基苯甲酸甲酯和 丙酯）、甜味劑等。所述抗腫瘤藥物可制成單元或多元劑型，各劑型包含為了產(chǎn)生所期望的 療效而計算出預(yù)定量的rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，以及合適的藥劑學(xué)賦形劑。
[0036] 所述的抗腫瘤藥物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，包括（但并不限于）：肌內(nèi)、腹膜 內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部給藥等。
[0037] 使用該藥物時，是將安全有效量的PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物施用于人，其中該安 全有效量的范圍優(yōu)選為〇. 5~50毫克/千克體重，更優(yōu)選為1~30毫克/千克體重。當(dāng) 然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是在熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi) 的。
[0038] 此外，本發(fā)明的偶聯(lián)物還可與其他治療藥物聯(lián)用，其中包括（但并不限于）：各種 細胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各種腫瘤化療藥物，如5-FU、氨甲喋呤等影響核酸生物合成 的藥物；氮芥、環(huán)磷酰胺等烷化劑類藥物；阿霉素、放線菌素 D等干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合 成的藥物；長春新堿、喜樹堿類等影響蛋白質(zhì)合成的藥物及某些激素類藥物，等等。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0040] (1)本發(fā)明的偶聯(lián)物兼具良好的藥代動力學(xué)性質(zhì)和腫瘤細胞殺傷能力，并且，本發(fā) 明的偶聯(lián)物比rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物具有更強的腫瘤細胞殺傷能力，比 rTRAIL突變體-單甲基化聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯(lián)物具有更長的半衰期。表明在本發(fā)明偶 聯(lián)物中，單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺、rTRAIL突變體三聚體、海兔毒素并非是單獨發(fā)揮各 自作用的，三者之間產(chǎn)生了較強的協(xié)同作用；
[0041] (2)本發(fā)明利用rTRAIL突變體三聚體上的游離巰基的空間位阻效應(yīng)，將rTRAIL 突變體三聚體先與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯(lián)再與帶連接臂的海兔毒素偶聯(lián)制備 本發(fā)明偶聯(lián)物，避免了先偶聯(lián)帶連接臂的海兔毒素導(dǎo)致帶連接臂的海兔毒素占據(jù)所有反應(yīng) 空間，而無法進一步偶聯(lián)單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺的情況；制備方法設(shè)計巧妙，反應(yīng)簡 單，可在同一體系中完成兩步修飾反應(yīng)，且調(diào)整投料量可得到不同性質(zhì)的產(chǎn)物；
[0042] (3)本發(fā)明將rTRAIL突變體三聚體先與單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺還有利于 提高rTRAIL突變體三聚體的水溶性，顯著減少下一步與帶連接臂的海兔毒素偶聯(lián)所導(dǎo)致 的沉淀，使得本發(fā)明偶聯(lián)物的制備得率均高于60%，遠遠高于rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備 得率（約25% )。
【附圖說明】
[0043] 圖1為具有不同PEG/MMAE偶聯(lián)比值的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒 素偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0044] 其中，聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物以下簡稱 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物，PEGfrTRAIL-MMAE2表示 PEG/MMAE 偶聯(lián)比值為 0. 5 的 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物，PEGfrTRAIL-MMAE1 表示 PEG/MMAE 偶聯(lián)比值為 1 的 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物，Peg2-FtrAIL-MMAE1 表示 PEG/MMAE 偶聯(lián)比值為 2 的 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物；
[0045] 圖2為rTRAIL突變體三聚體與PEG和MMAE反應(yīng)后的SDS-PAGE分析；
[0046] 其中，M為低分子量蛋白質(zhì)marker ;泳道1為rTRAIL突變體N109C三聚體；泳道2 為rTRAIL突變體N109C三聚體先與mPEG-MAL反應(yīng)后的結(jié)果；泳道3為rTRAIL突變體N109C 三聚體先與mPEG-MAL反應(yīng)，再和vcMMAE反應(yīng)的結(jié)果；泳道4為rTRAIL突變體N109C三聚 體先與vcMMAE反應(yīng)的結(jié)果；泳道5為rTARIL突變體N109C三聚體先與vcMMAE反應(yīng)，再和 mPEG-MAL反應(yīng)的結(jié)果；泳道6為rTRAIL突變體N109C三聚體先與mPEG-MAL反應(yīng)30秒，再 和vcMMAE反應(yīng)的結(jié)果；
[0047] 圖 3 為 rTRAIL 突變體 N109C、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物的 分子篩分析結(jié)果；
[0048] 圖 4 為 rTRAIL114_281、rTRAIL 突變體 N109C、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的圓二色譜分析結(jié)果；
[0049] 圖 5 為分別經(jīng) MMAE、rTRAIL 突變體、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE 偶 聯(lián)物處理8小時后的乳腺癌細胞系MCF-7的細胞周期分析結(jié)果；
[0050] 其中，Gl、G2、S、G2/M均為細胞周期中的各階段，％ G2/M標(biāo)示處于G2/M期的細胞 數(shù)量占總細胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)；
[0051] 圖 6 為生理鹽水、rTRAIL114_281、MMAE、BSA-MMAE 偶聯(lián)物、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物分別處理荷瘤裸小鼠模型后小鼠體內(nèi)腫瘤體積的變化圖；
[0052] 其中，"iv. q2dX4"表示尾靜脈注射，每兩天給藥，共給藥四次；
[0053] 圖 7 生理鹽水、rTRAIL114_281、MMAE、BSA-MMAE 偶聯(lián)物、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物分別處理荷瘤裸小鼠模型后小鼠體內(nèi)腫瘤重量的變化圖；
[0054] 圖 8 為生理鹽水、rTRAIL114_281、MMAE、BSA-MMAE 偶聯(lián)物、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的原位凋亡活性分析結(jié)果；
[0055] 圖 9 為理鹽水、rTRAIL114_281、MMAE、BSA-MMAE 偶聯(lián)物、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的動物毒性分析結(jié)果；
[0056] 圖 10 為理鹽水、rTRAIL114_281、MMAE、BSA-MMAE 偶聯(lián)物、rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物和 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物分別給藥后各實驗組動物的體重變化圖；
[0057] 圖11為rTRAIL突變體、rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物和PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物給藥后 SD大鼠體內(nèi)血藥濃度隨時間的變化圖；
[0058] 圖12為PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的腫瘤靶向能力研宄結(jié)果圖；
[0059] 圖13為PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備流程圖和原理圖。
【具體實施方式】
[0060] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0061] 實施例1制備聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物
[0062] 1、具有不同PEG/MMAE比值的PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備（如圖1)
[0063] (I) PEG/MMAE 比值為 0· 5 (即 N109C 三聚體、PEG、MMAE 的摩爾比為 1:1:2)
[0064] 一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物（以下簡稱 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物）的制備方法，包括以下步驟：
[0065] ①制備rTRAIL突變體N109C ;
[0066] rTRAIL突變體N109C的制備方法參見授權(quán)公告號為CN 102936281B的中國發(fā)明專 利中【具體實施方式】第1~6部分，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0067] ②取 Img 的 rTRAIL 突變體 N109C 溶解于 ImL PBS (pH 6. 0,含 10 μ M ZnCl2)中，加 入10 μ L十倍量的磷酸三（β-氯乙基）酯（TCEP)，30°C水浴反應(yīng)0. 5h ;邊攪拌邊加入用 IOOyL PBS (pH 6.0)溶解的1.5倍過量的單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺（mPEG-MAL，其中 PEG分子量為15000Da)，在20°C反應(yīng)30s ;
[0068] ③向反應(yīng)體系中加入10倍過量的vcMMAE (即帶連接臂的海兔毒素，由江陰康諾泰 生物技術(shù)有限公司代為合成），在20°C下反應(yīng)60min，加入過量的半胱氨酸終止反應(yīng)；
[0069] ④用Millipore截留分子量為IOkDa的超濾管除去反應(yīng)體系中的小分子。所得到 的偶聯(lián)物過0. 22 μ m孔徑的水膜除菌，-20°c保存?zhèn)溆茫?br>[0070] ⑤采用吸光光度法測定（280nm)所得偶聯(lián)物的制備得率；利用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳法測定所得偶聯(lián)物的相對分子質(zhì)量，并用Quantity One軟件