定量各單體的量，得 到偶聯(lián)物中PEG/MMAE偶聯(lián)比值。
[0071] (2) PEG/MMAE 比值為 1(即 N109C 三聚體、PEG、MMAE 的摩爾比為 1:1:1)
[0072] ①取 Img 的 rTRAIL 突變體 N109C 溶解于 ImL PBS (pH 6.0,含 10 μ M ZnCl2)中， 加入10 UL十倍量的磷酸三（β -氯乙基）酯（TCEP)，37°C水浴反應(yīng)2h ;邊攪拌邊加入用 IOOyL PBS (pH 6.0)溶解的2倍過(guò)量的單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺（mPEG-MAL，其中PEG 分子量為5000Da)，在25°C反應(yīng)40min ;
[0073] ②向反應(yīng)體系中加入4倍過(guò)量的vcMMAE (由江陰康諾泰生物技術(shù)有限公司代為合 成），在25°C下反應(yīng)40min，加入過(guò)量的半胱氨酸終止反應(yīng)；
[0074] ③用Millipore截留分子量為IOkDa的超濾管除去反應(yīng)體系中的小分子。所得到 的偶聯(lián)物過(guò)0. 22 μ m孔徑的水膜除菌，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0075] ④采用吸光光度法測(cè)定（280nm)所得偶聯(lián)物的制備得率；利用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳法測(cè)定所得偶聯(lián)物的相對(duì)分子質(zhì)量，并用Quantity One軟件定量各單體的量，得 到偶聯(lián)物中PEG/MMAE偶聯(lián)比值。
[0076] (3) PEG/MMAE 比值為 2 (即 N109C 三聚體、PEG、MMAE 的摩爾比為 1:2:1)
[0077] ①取 Img 的 rTRAIL 突變體 N109C 溶解于 ImL PBS (pH 6.0,含 10 μ M ZnCl2)中， 加入10 UL十倍量的磷酸三（β -氯乙基）酯（TCEP)，40°C水浴反應(yīng)3h ;邊攪拌邊加入用 IOOyL PBS (pH 6.0)溶解的8倍過(guò)量的單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺（mPEG-MAL，其中PEG 分子量為3000Da)，在30°C反應(yīng)Ih ;
[0078] ②向反應(yīng)體系中加入2倍過(guò)量的vcMMAE (由江陰康諾泰生物技術(shù)有限公司代為合 成），在30°C下反應(yīng)30min，加入過(guò)量的半胱氨酸終止反應(yīng)；
[0079] ③用Millipore截留分子量為IOkDa的超濾管除去反應(yīng)體系中的小分子。所得到 的偶聯(lián)物過(guò)0. 22 μ m孔徑的水膜除菌，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0080] ④采用吸光光度法測(cè)定（280nm)所得偶聯(lián)物的制備得率；利用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳法測(cè)定所得偶聯(lián)物的相對(duì)分子質(zhì)量，并用Quantity One軟件定量各單體的量，得 到偶聯(lián)物中PEG/MMAE偶聯(lián)比值。
[0081] 吸光光度法的測(cè)定結(jié)果顯示，PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備得率均高于60%， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備得率（約25% )，表明rTRAIL先經(jīng)歷mPEG-MAL修飾 再偶聯(lián)vcMMAE的方式可顯著提高PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的制備得率。
[0082] 2、反應(yīng)時(shí)間對(duì)PEG/MMAE比值的影響
[0083] 以PEG/MMAE比值為1舉例（附圖2)，在修飾過(guò)程中，分為三種條件：①先加 mPEG-MAL反應(yīng)40分鐘，再加 vcMMAE反應(yīng)40分鐘；②先加 vcMMAE反應(yīng)40分鐘，再加 mPEG-MAL反應(yīng)40分鐘；③先加 mPEG-MAL反應(yīng)30秒，再加入vcMMAE反應(yīng)40分鐘。其余反 應(yīng)條件均相同。各條件下的反應(yīng)產(chǎn)物用分離膠濃度為12%的SDS-PAGE分析偶聯(lián)結(jié)果。
[0084] 結(jié)果如附圖2所示：只有在先加 mPEG-MAL (泳道2)再加 vcMMAE (泳道3)的 條件下，才會(huì)出現(xiàn)PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的條帶（N109C條帶上方的條帶），且無(wú)論 mPEG-MAL與rTRAIL三聚體的反應(yīng)時(shí)間是30秒（泳道6)還是40分鐘（泳道3)，均可得到 PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物，且得率相近。而在先加 vcMMAE (泳道4)再加 mPEG-MAL (泳道5) 的條件下，則無(wú)法得到PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物
[0085] 上述結(jié)果表明mPEG-MAL和vcMMAE在修飾rTRAIL突變體三聚體的過(guò)程中存在空 間位阻，先偶聯(lián)分子量較大的mPEG-MAL，才能留下空間給更小的vcMMAE ;若是先偶聯(lián)分子 量較小的vcMMAE，則它就會(huì)"占據(jù)"所有能偶聯(lián)的突變半胱氨酸上的游離巰基（三個(gè)），使 得mPEG-MAL沒(méi)有偶聯(lián)的位置。
[0086] 3、PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)分析
[0087] 以 PEG/MMAE 比值為 1 的 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物為例，分子篩（size-exclusion chromatography, SEC)色譜對(duì)PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物進(jìn)行分析，以分析經(jīng)歷雙重修飾的 rTRAIL突變體三聚體是否保持了其活性三聚體結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0088] 如圖3所示，rTRAIL突變體N109C由于相比rTRAIL多突變出一個(gè)半胱氨酸殘基， 因此形成了分子內(nèi)錯(cuò)配的二硫鍵導(dǎo)致二聚體的形成，在分子篩結(jié)果中表現(xiàn)為三聚體峰后出 現(xiàn)一個(gè)二聚體峰；而rTRAIL突變體N109C與MMAE的偶聯(lián)產(chǎn)物rTRAIL-MMAE則只出現(xiàn)了三 聚體的峰，表明還原、偶聯(lián)等步驟后rTRAIL突變體二聚體部分解聚且與MMAE的偶聯(lián)產(chǎn)物重 新形成了三聚體；雙修飾產(chǎn)物PEG-rTRAIL-MMAE同樣也是三聚體。另外該結(jié)果也表明除去 反應(yīng)體系中的小分子后，剩余的即是均一的偶聯(lián)物。
[0089] 4、圓二色譜分析PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成
[0090] 以 PEG/MMAE 偶聯(lián)比值為 1 的 PEG-rTRAIL-MMAE 偶聯(lián)物為例，利用 Chirascan Plus CD spectrophotometer (Applied Photophysics Co. ,Ltd)圓二色譜儀在遠(yuǎn)紫外段 200 ~ 260nm掃描rTRAIL114_281 (野生型rTRAIL的114-281氨基酸片段）、rTRAIL突變體N109C及 rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物、PEG-rTRAIL-MMAE偶聯(lián)物，模擬計(jì)算得到各樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的組 成比例，分析結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。
[0091] 表 1
[0092]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，rTRAIL突變體的氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示，其特征在于，所述rTRAIL突變體三聚體上偶聯(lián)有單甲氧基聚乙二 醇馬來(lái)酰亞胺以及帶連接臂的海兔毒素。
2. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，其特征在 于，rTRAIL突變體三聚體、單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺、帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為 I: (1 ~2) : (2 ~1) 〇
3. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，其特征在 于，所述單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺的分子量為3000~15000Da。
4. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，其特征在 于，所述連接臂為馬來(lái)酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽。
5. 如權(quán)利要求1~4任一所述的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物的 制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將rTRAIL突變體多聚體解聚，重新聚合得到rTRAIL突變體三聚體； (2) 將rTRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺混合反應(yīng)，得到聚乙二 醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物； (3) 將聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素混合反應(yīng)，得到 所述聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，rTRAIL突變體三聚體與單 甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺混合反應(yīng)的條件為：TRAIL突變體三聚體與單甲氧基聚乙二醇 馬來(lái)酰亞胺的摩爾比為1:1. 5~8,反應(yīng)溫度20~30°C，反應(yīng)時(shí)間30s~lh。
7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，聚乙二醇-rTRAIL突變體 三聚體偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素混合反應(yīng)的條件為：聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體 偶聯(lián)物與帶連接臂的海兔毒素的摩爾比為1:2~10,反應(yīng)溫度20~30°C，反應(yīng)時(shí)間30~ 60min〇
8. 如權(quán)利要求1~4任一所述的聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物在 制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物用于誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)有 死亡受體的腫瘤細(xì)胞凋亡。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為抗結(jié)腸癌藥物、抗血癌 藥物、抗卵巢癌藥物、抗胃癌藥物、抗肺癌藥物、抗乳腺癌藥物或抗肝癌藥物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。一種聚乙二醇-rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物，rTRAIL突變體的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，rTRAIL突變體三聚體上偶聯(lián)有單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺以及帶連接臂的海兔毒素。本發(fā)明偶聯(lián)物比rTRAIL突變體三聚體-海兔毒素偶聯(lián)物具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，比rTRAIL突變體-單甲基化聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物具有更長(zhǎng)的半衰期；表明在本發(fā)明偶聯(lián)物中，單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺、rTRAIL突變體三聚體、海兔毒素并非是單獨(dú)發(fā)揮各自作用的，三者之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的協(xié)同作用。
【IPC分類(lèi)】A61P35-00, C07K14-525, A61K38-19, A61K47-48, C07K1-107
【公開(kāi)號(hào)】CN104744584
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510133532
【發(fā)明人】潘利強(qiáng), 陳樞青
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月25日