診斷人shox2基因和人rassf1a基因甲基化的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種診斷人SH0X2基因和人 RASSF1A基因甲基化的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌已經(jīng)成為人類癌癥死亡的主要原因之一。在中國(guó)肺癌是發(fā)病率最高的癌癥， 且發(fā)病率和死亡率迅速增長(zhǎng)。肺癌的發(fā)生率和死亡率是所有腫瘤中最高的，但是肺癌卻不 是診斷的最多的腫瘤，在美國(guó)，乳腺腫瘤和前列腺腫瘤有更高的診斷率，原因是可W早期診 斷從而可W早期治療，大大提高了 5年生存率（分別為89和99% )，而肺癌的5年生存率 才 15%。
[0003] 在臨床實(shí)踐中，肺癌早期診斷一直是難點(diǎn)，癌癥的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)癌癥患者的有效治 療是非常重要的。目前對(duì)癌癥的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、影像學(xué)檢測(cè)和組織病理學(xué)檢查等， 但有許多癌癥臨床癥狀出現(xiàn)較晚，并且活體取樣檢測(cè)也困難，嚴(yán)重影響了癌癥的早期診斷 和病人的預(yù)后。相對(duì)于組織活檢，肺泡灌洗液、血漿、疲液等標(biāo)本容易獲得，對(duì)受檢者也沒(méi)有 創(chuàng)傷。目前，在外周循環(huán)血中，同一基因異常甲基化的DNA只占全部DNA的極小部分，大約 0.1%~1%，該些非甲基化DNA與甲基化DNA只存在微小的差異，需要從高度復(fù)雜的"背景" 中檢測(cè)出異常的甲基化DNA。另外循環(huán)血中的DNA通常都已經(jīng)降解（通常為幾十到一百多 堿基對(duì)）的片段，所W需要特別的抽提和檢測(cè)技術(shù)才能獲得較高的靈敏度。
[0004] 隨著技術(shù)上的快速發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物發(fā)展成為繼影像診斷、病理診斷之后的腫瘤 診斷治療新的領(lǐng)域，對(duì)腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)和治療產(chǎn)生了重大影響。腫瘤標(biāo)志物可W在體液或 組織中檢測(cè)到，能夠反映腫瘤的存在、分化程度、預(yù)后估計(jì)和判斷治療效果等。早期肺癌由 于常無(wú)特殊癥狀而幾乎不被醫(yī)生和患者察覺(jué)，用常規(guī)的診斷方法也難W早期發(fā)現(xiàn)和早期定 性診斷，加之一些腫瘤標(biāo)記物僅能作為肺癌的初篩或輔助診斷提示而不能確診，因此肺癌 的早期診斷較為困難。目前，隨著基因診斷技術(shù)不斷發(fā)展，給肺癌的早期診斷帶來(lái)了希望， 其中一個(gè)領(lǐng)域就是甲基化DNA檢測(cè)。DNA甲基化幾乎在所有腫瘤中都有發(fā)生，使其成為腫瘤 診斷的一個(gè)可靠祀標(biāo)。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件，在疾病確診前就能被檢測(cè)出 來(lái)，是腫瘤早期診斷、患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、臨床病程監(jiān)控和療效評(píng)估的潛在指標(biāo)。
[0005]DNA甲基化作為一種新型分子標(biāo)志，在腫瘤診斷中的重要性日益受到重視，其優(yōu) 勢(shì)主要為；其一，在腫瘤形成過(guò)程中，啟動(dòng)子超甲基化的發(fā)生頻率很高，甚至高于基因突變， 其中不乏與腫瘤形成有關(guān)的重要基因；其二，甲基化是腫瘤發(fā)生早期的重要事件；其S， DNA甲基化穩(wěn)定存在，可通過(guò)PCR放大效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。因此，甲基化檢測(cè)對(duì)腫瘤早期診斷 有潛在的應(yīng)用價(jià)值。近來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)血漿中一些基因的甲基化DNA的含量水平用做 早期診斷，敏感性要好于已有的蛋白質(zhì)血清標(biāo)志物，其中比較突出的有與早期肺癌相關(guān)的 eye1in-dependentkinaseinhibitor2Agenepl6 (pl6)，H-cadherin(CDH13)等基因。吸 煙是肺癌的最主要原因，在正常吸煙人群的呼吸道中發(fā)現(xiàn)了幾種在人類肺癌中經(jīng)常出現(xiàn)的 基因異常。其中，研究較多的是Pl6基因異常甲基化。對(duì)正常吸煙人群疲標(biāo)本中的脫落細(xì) 胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Pl6基因異常甲基化頻率較高，而正常非吸煙人群疲標(biāo)本中則沒(méi)有發(fā) 現(xiàn)該變化，說(shuō)明該一基因改變可能與早期呼吸道腫瘤發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)。疲液中相關(guān)基因 啟動(dòng)子甲基化程度隨著腫瘤危險(xiǎn)性增高而增高，而CDKN2A/P16和/或MGMT基因在明確肺 鱗癌診斷的3年前已可W在疲中檢出。目前，有很多研究檢測(cè)血液、疲液、肺泡灌洗液中的 細(xì)胞或DNA甲基化狀態(tài)，W期找到用于肺癌早期診斷的標(biāo)志物。
[0006] 盡管現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些基因的DNA甲基化與肺癌的相關(guān)性，但是目前本 領(lǐng)域中仍然需要進(jìn)一步地研究能夠切實(shí)地應(yīng)用于肺癌診斷的相關(guān)基因，W及開(kāi)發(fā)出具有較 高的檢測(cè)準(zhǔn)確性的檢測(cè)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種診斷人SH0X2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和 試劑盒。
[000引在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于檢測(cè)肺癌的試劑盒，所述的試劑盒中包括：特 異性檢測(cè)人甜0X2基因的DNA甲基化的檢測(cè)試劑；和特異性檢測(cè)人RASSF1A基因的DNA甲 基化的檢測(cè)試劑。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的DNA甲基化序列含有CpG二核巧酸結(jié)構(gòu)，并且CpG二核巧 酸結(jié)構(gòu)的C堿基帶有甲基基團(tuán)。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，試劑盒中，所述的特異性檢測(cè)人SH0X2基因的DNA甲基化的檢測(cè) 試劑是針對(duì)人SH0X2基因的引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對(duì)人SH0X2基因中 SEQIDNO:3經(jīng)亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽修飾后的序列（SEQIDNO:4);或所述 的特異性檢測(cè)人RASSF1A基因的DM甲基化的檢測(cè)試劑是針對(duì)人RASSF1A基因的引物和探 針；較佳地，所述的引物和探針針對(duì)人RASSF1A基因中SEQIDNO: 1經(jīng)亞硫酸氨鹽或重亞硫 酸氨鹽或阱鹽修飾后的序列（SEQIDNO:2)。
[OCm] 在另一優(yōu)選例中，試劑盒中，所述的特異性檢測(cè)人SH0X2基因的DNA甲基化的檢測(cè) 試劑是；SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:18所示的引物W及SEQ ID NO:化所示的探針；或所述 的特異性檢測(cè)人RASSF1A基因的DNA甲基化的檢測(cè)試劑是；SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:10 所示的引物W及SEQ ID NO:22所示的探針。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，試劑盒中，所述的試劑盒中還包括；特異性檢測(cè)內(nèi)參基因的檢測(cè) 試劑浪佳地，所述的特異性檢測(cè)內(nèi)參基因的檢測(cè)試劑是針對(duì)人e-actin基因的引物和探 針；更佳地，所述的引物和探針針對(duì)人e-actin基因中SEQIDNO: 5經(jīng)亞硫酸氨鹽或重亞 硫酸氨鹽或阱鹽修飾后的序列（SEQIDN0:6);更佳地，所述的特異性檢測(cè)內(nèi)參基因的DNA 甲基化的檢測(cè)試劑是記69 10^:19和569 10^:21所示的引物^及569 10^:26所示 的探針。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)參基因用于指示DNA提取和修飾的質(zhì)量。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，試劑盒中，針對(duì)每一基因的探針連接有特定的巧光基團(tuán)；較佳 地，針對(duì)人SH0X2基因的探針標(biāo)記VIC巧光素，針對(duì)人RASSF1A基因的探針標(biāo)記FAM巧光素， 針對(duì)人0 -actin基因的探針標(biāo)記CY5巧光素。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，該試劑盒中，針對(duì)人甜0X2基因的引物和探針的比例（引物：探 針）為；0. 2 ;0. 06(例如，在試劑盒中設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系引物終濃度：探針終濃度=0. 2uM: 0.06UM);或該試劑盒中，針對(duì)人RASSF1A基因的引物和探針的比例（引物：探針）為；0. 2 ; 0. 〇6(例如，在試劑盒中設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系引物終濃度：探針終濃度=0. 2uM;0. 06uM);或 該試劑盒中，針對(duì)人0 -actin基因的引物和探針的比例（引物：探針）為；0. 67 ;0. 02(例 如，在試劑盒中設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系引物終濃度：探針終濃度=0. 67uM;0. 02uM)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，該試劑盒中，還包括（但不限于）；DNA聚合酶（如Taq酶）、 dNTPs、Mg"離子或包含DNA聚合酶（如Taq酶）、dNTPs、Mg"離子的PCR體系；較佳地，所述 的包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg"離子的PCR體系中，所述的Mg"離子濃度為3. 5 ± 0. 5mM(較 佳地3. 5 + 0. 3mM);或所述的dNTPs濃度為0. 25 + 0. 3mM(較佳地0. 25 + 0.ImM);或所述的 DNA聚合酶為1. 5 + 0. 2U(較佳地1. 5 + 0. 1U)。較佳地，所述的試劑盒中還包括；亞硫酸氨 鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括（但不限于）；質(zhì)控品、陰性對(duì)照和/或 說(shuō)明書。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供特異性檢測(cè)人SH0X2基因和人RASSF1A基因的DNA甲 基化的試劑的用途，用于制備檢測(cè)肺癌的試劑盒。
[0019] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的特異性檢測(cè)人甜0X2基因的DNA甲基化的檢測(cè)試劑是 針對(duì)人SH0X2基因的引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對(duì)人SH0X2基因中SEQID N0:3經(jīng)亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽修飾后的序列（SEQIDN0:4);更佳地，所述的特 異性檢測(cè)人甜0X2基因的DNA甲基化的檢測(cè)試劑是；SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 18所示的 引物W及SEQIDN0:25所示的探針；或所述的特異性檢測(cè)人RASSFIA基因的DNA甲基化的 檢測(cè)試劑是針對(duì)人RASSF1A基因的引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對(duì)人RASSF1A 基因中SEQIDNO: 1經(jīng)亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽修飾后的序列（SEQIDNO: 2);更 佳地，所述的特異性檢測(cè)人RASSF1A基因的DM甲基化的檢測(cè)試劑是；SEQIDNO: 7和SEQ IDNO: 10所示的引物W及SEQIDN0:22所示的探針。
[0020] 在本發(fā)明的另