一方面，提供一種體外非診斷性地檢測人SH0X2基因和人RASSFIA 基因的DM甲基化的方法，所述方法包括：
[0021] (1)將待測樣品進行亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽處理，獲得經(jīng)修飾的待測 樣品；
[002引 似利用前面所述的用于檢測肺癌的試劑盒對步驟（1)的經(jīng)修飾的待測樣品進行 檢測，獲得人甜0X2基因的DNA甲基化情況和人RASSF1A基因的DNA甲基化情況。
[0023] 在一個優(yōu)選例中，若人甜0X2基因DNA甲基化陽性和/或人RASSF1A基因的DNA 甲基化陽性，則表明待測樣品的提供者為肺癌高?；蚍伟┗颊?。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，在一個反應(yīng)管內(nèi)進行多個核酸片段檢測；并同時在一個反應(yīng)管 內(nèi)進行多個波段巧光信號檢測，通過不同的巧光信號區(qū)別不同的DNA片段?；蛘撸蒞在 不同的反應(yīng)管內(nèi)進行不同核酸片段檢測；并同時在一個反應(yīng)管內(nèi)進行單個波段巧光信號檢 巧。，通過巧光信號區(qū)別不同的DNA片段。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣本來源于；含有細胞的樣本提取的核酸，如肺泡灌 洗液，取自病變部位的組織，胸水，疲液等；或含有來源于細胞的核酸的樣本，如血漿，血清 等。
[0026] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0027] 圖1、人SH0X2基因和人RASSF1A基因甲基化DNA檢測特異性。
[002引 圖2、人甜0X2基因和人RASSF1A基因甲基化DNA檢測靈敏度（VIC信號），圖中數(shù) 字表示細胞數(shù)。
[0029] 圖3、人甜0X2基因和人RASSF1A基因甲基化DNA檢測靈敏度（FAM信號），圖中數(shù) 字表示細胞數(shù)。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次揭示一種通過協(xié)同檢測兩種肺癌標志物的甲基化 DNA來提高肺癌檢出率的方法，所述的肺癌標志物是人SH0X2基因和人RASSF1A基因。本發(fā) 明人還優(yōu)化了PCR擴增反應(yīng)程序，進一步提高了擴增效率。本發(fā)明人還優(yōu)化了檢測人甜0X2 基因和人RASSF1A基因甲基化DNA的試劑、檢測方法。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[003。 如本文所用，"待測樣本"、"待測樣品"或"待測核酸（如DNA)樣品"是指待檢測的 核酸樣本，其中含有一種核酸或多種核酸，需要了解其中是否存在目標核酸。本發(fā)明中，所 述的待測樣本可W是；肺泡灌洗液，取自病變部位的組織，胸水，疲液等；或含有來源于細 胞的核酸的樣本，如血漿，血清等。
[0032] 如本文所用，"目標核酸"是指感興趣的核酸片段，其是人甜0X2基因和人RASSF1A 基因甲基化DNA特異性片段。
[0033] 如本文所用，"探針"是指一種具有已知核巧酸序列的單鏈核酸，其具有與目標核 酸基本上互補的核巧酸序列結(jié)構(gòu)，可W與"目標核酸"形成雙鏈。所述的"探針"可W攜帶 標記物。例如，標記物可W連接在探針的5'末端或3'末端。
[0034] 人SH0X2(shortsta1:urehomeobox2)基因是矮小同源盒基因家族的一員，其核 巧酸序列可W與GenBank登錄號；NC_000003的序列基本相同。其基因表達調(diào)控與器官發(fā) 育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SH0X2基因在胚胎時期表達于中胚層和外胚層，對骨骼、屯、臟和神 經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起到重要作用。SH0X2基因在多種實體腫瘤中表達異常，如肺癌、乳腺癌、腎癌 等。
[00；35]人RASSFlA(Ras-associationdomainfamily1A，RASSF1A)基因是Ras相關(guān)區(qū)域 家族lA基因，其核巧酸序列可W與GenBank登錄號；DQ444319的序列基本相同。RASSFIA調(diào) 控的祀基因設(shè)及基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架、細胞周期、細胞黏附及調(diào)亡等多方面內(nèi)容， 具有廣泛的生物學(xué)作用。而RASSF1A作為一種新型腫瘤抑制基因，其在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過 程中的作用尤為重要。目前認為，RASSF1A基因表達失活主要與啟動子區(qū)異常的高甲基化、 雜合性缺失及染色體缺失有關(guān)。
[003引本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在臨床肺癌患者中，S冊X2基因甲基化DNA陰性的腫瘤標本 中，多數(shù)標本會出現(xiàn)RASSF1A基因甲基化DNA陽性，聯(lián)合檢測人甜0X2基因和人RASSF1A基 因甲基化DNA較分別單獨檢測兩種基因，肺癌檢測的準確率（檢出率）可W顯著提高。
[0037] 基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，提供了特異性檢測人SH0X2基因和人RASSF1A基因 的DM甲基化的試劑的用途，用于制備檢測肺癌的試劑盒。
[0038] 進一步地，本發(fā)明人進行了篩選和反復(fù)試驗，提供了一類特別適合于人SH0X2基 因和人RASSF1A基因甲基化DNA特異性片段檢測的引物和探針?；蚣谆稽c的選擇 直接與臨床檢測靈敏度相關(guān)，一般都在基因的啟動子區(qū)域，但很多基因與腫瘤相關(guān)的甲基 化位點也有可能位于第一內(nèi)含子與第一外顯子區(qū)域。經(jīng)過大量的實驗和比較，本發(fā)明人選 取了人SH0X2基因和人RASSF1A基因特定的甲基化區(qū)域，如對應(yīng)于人SH0X2基因的SEQID N0:3序列，或?qū)?yīng)于RASSF1A基因的SEQIDN0:1序列。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人還設(shè)計了高 度特異的引物來擴增出不同的目的片段，并用高度特異的探針來識別。
[0039] 引物探針的成功設(shè)計對于實時巧光PCR檢測是非常重要一環(huán)，亞硫酸鹽修飾后促 使DNA鏈中的"C"轉(zhuǎn)化為叩"，導(dǎo)致GC含量降低，使PCR反應(yīng)后在序列中出現(xiàn)長的連續(xù)"T"， 容易引起DNA鏈的斷裂。此外，純化過程中也會導(dǎo)致DNA的丟失。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物 的長度大于300bp時，就很難W亞硫酸鹽修飾后的DNA為模板進行擴增，200bp的長度比較 合適；與標準PCR不同的是，亞硫酸鹽修飾降低了模板DNA的GC含量，使序列中出現(xiàn)長的連 續(xù)"T"，導(dǎo)致很難選擇具有合適的Tm值及穩(wěn)定的引物；另一方面，為了區(qū)別亞硫酸鹽修飾和 沒有亞硫酸鹽修飾處理W及未完全亞硫酸鹽修飾的DNA，需要引物有足夠數(shù)量的"C"，該些 都增加了選擇穩(wěn)定引物的困難。針對該些困難，本發(fā)明人在充分序列研究的基礎(chǔ)上，選擇優(yōu) 化了合適的區(qū)段，設(shè)計了高度特異的擴增引物和探針，建立了一種靈敏度高的人甜0X2基 因和人RASSF1A基因甲基化DNA特異性檢測方法和試劑盒。
[0040] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的方法或試劑盒中，還應(yīng)用內(nèi)參來指示DNA提取 和修飾的質(zhì)量。所述的內(nèi)參較佳地例如為0-actin。
[0041] 本發(fā)明的方法中，需要對提取的DM進行化學(xué)修飾，亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽 或阱鹽修飾均可應(yīng)用于該種化學(xué)修飾。研究過程中，本發(fā)明人通過亞硫酸鹽測序方法，比較 了QIAGEN公司和ZYM0公司的亞硫酸鹽修飾試劑盒，在轉(zhuǎn)化率與回收率上，二者沒有明顯差 另IJ，從成本考慮，選擇ZYM0公司的亞硫酸鹽修飾試劑盒。
[0042] 根據(jù)臨床檢測的需要，利用實時巧光PCR技術(shù)進行人SH0X2基因和人RASSF1A基 因甲基化DNA特異性片段檢測是較為優(yōu)選的。當應(yīng)用實時巧光PCR進行檢測時，所述的探針 連接有適合于甄別不同基因甲基化DNA片段的巧光基團。探針的前端標記有巧光基團，另 一端標記有澤滅基團，其中澤滅基團可澤滅巧光基團發(fā)出的巧光。當PCR擴增反應(yīng)進行時， 利用聚合酶的正向外切活性將帶有巧光基團的堿基切離，游離后的巧光基團不再受澤滅基 團的影響，在激發(fā)光的作用下可發(fā)射一定波長的巧光信號。隨著PCR產(chǎn)物的不斷積累，巧光 信號不斷地增強，從而可W檢測到特異甲基化DNA的存在。
[0043] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，為方便臨床使用，在進行檢測時，采用在同一個反應(yīng)管中 加入S種不同巧光基團標記的S種特定的探針（對應(yīng)于人SH0X2基因，人RASSF1A基因和 0 -actin基因），在一個反應(yīng)管內(nèi)同時指示3種目的甲基化DNA片段的存在情況。
[0044] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，為方便臨床使用，檢測探針標記的巧光基團可W是VIC、 R0X、FAM、切5、肥X、TET、JOE、肥D等；澤滅基團可W是TAMRA、B冊、MGB、D油巧1。W適用于 目前臨床檢測常用的多通道PCR檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)在一個反應(yīng)管中進行多色巧光檢測。
[0045] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選方式中，本發(fā)明人還優(yōu)化了PCR擴增反應(yīng)，進一步提高了擴 增效率。包括優(yōu)化酶的用量、dNTPs用量，引物探針在PCR體系中的濃度，使得PCR反應(yīng)后， ct值相對集中，達到理想效果。應(yīng)理解，在不優(yōu)化的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)技術(shù)效果，而進行PCR擴增程序和擴增體系的優(yōu)化后，則效果更為理想。
[0046] 本發(fā)明的檢測試劑被置于試劑盒中，從而便于人們應(yīng)用。除了引物和探針試劑，試 劑盒中還可包含：亞硫酸氨鹽或重亞硫酸氨鹽或阱鹽，PCR反應(yīng)液，質(zhì)控品，陰性對照和/或 使用說明書。
[0047] 本發(fā)明的方法和試劑盒特別適合于肺癌輔助診斷和早期診斷，具有高靈敏度、高 特異性、操作簡便、檢測周期短等特點?？捎行岣邫z測準確率，并減少結(jié)果的假陰性。
[0048] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第=版，科學(xué)出版社，2002中