所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0049] 實施例1、檢測祀基因的選擇
[0050] 甲基化DNA作為檢測祀標具有明顯的優(yōu)點，相比蛋白質(zhì)類標志物，DNA是可W擴 增的，并且很容易檢測到；與突變類標志物相比，甲基化DNA都位于基因的特定部位，一般 在啟動子區(qū)，使檢測變得更容易和方便。為了完成本發(fā)明，發(fā)明人查閱了大量文獻，在報道 的與肺癌相關(guān)的基因中，選擇有代表性的pl6、H-ca化erin(C畑13)、SH0X2、H0XA9、RAR0、 RASSF1A作為候選的檢測基因，研究各個基因甲基化位點分布情況，設(shè)計檢測的引物探針分 別用于檢測。各基因檢測引物探針如下：
[0051] pl6的檢測引物和探針為：
[0052]pl6 引物F;ACGTCGTGAGCGAGTGTTC(沈QIDN0:27);
[0053]pl6 引物R;TACCAACGCTAACTCTAACGAA(SEQIDN0:28);
[0054]pl6 探針；ROX-CTTCCGACTAATACCCCCGAAA-B冊（SEQIDN0:29);
[00巧]H-ca化erin(C畑13)的檢測引物和探針為；
[0056]引物F;GAAAATATGTTTAGTGTAGTCGCGT(沈QIDN0:30);
[0057]引物R;ACGCACAAAACGAACGAAAT(沈QIDN0:31);
[0058]探針；CY5-TTTTATCCGACTAGAAACGCCCG-B冊（SEQIDN0:32);
[0059]S冊X2的檢測引物和探針為；
[0060]引物F;TTGTTTTTGGGTTCGGGTT(SEQIDN0:12)
[0061]引物R;CATAACGTAAACGCCTATACTCG(SEQIDNO: 16)
[0062]探針；VIC-ATCGAACAAACGAAACGAAAATTACC-B冊（SEQIDN0:24)
[0063] 冊XA9的檢測引物和探針為；
[0064]引物F;GGTATATCGTAGCGGGTATAGC(沈QIDN0:33);
[0065]引物R;AACTTCCAATCCAAAACGACG(SEQIDN0:34);
[0066]探針；FAM-TTCGTCGCGTGTATTGGGTTTTAC-B冊（SEQIDN0:35);
[0067]RAR0的檢測引物和探針為：
[0068]引物F;CGAGAACGCGAGCGATTC(SEQIDN0:36);
[0069]引物R;AACCTTCCGAATACGTTCCG(SEQIDN0:37);
[0070]探針；VIC-TCCTACCCCGACGATACCCAAAC-B冊(SEQIDN0:38);
[0071] RASSFIA的檢測引物和探針為；
[0072]引物F;CGGGGTTCGTTTTGTGGTTTC(SEQIDN0:7)
[0073]引物R;CCGATTAAATCCGTACTTCGC(沈QIDN0:10)
[0074]探針；FAM-TCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGT-B冊（SEQIDN0:22)
[00巧]實驗過程：
[007引 1、提取DM
[0077] 收集確診肺癌患者的標本和非腫瘤患者標本，分離細胞，W天根生化科技（北京） 有限公司基因組DNA提取試劑盒值P304)為例，提取DNA。
[0078] 2、DNA修飾
[0079]WZYM0RESEARCH生物公司試劑盒EZDNAMethylation-DirectTMIQT值5020) 說明亞硫酸鹽修飾。
[0080] 3、擴增與檢測
[0081] 如下配制10X引物探針mix。
[0082]
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測肺癌的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括： 特異性檢測人SH0X2基因的DNA甲基化的檢測試劑；和 特異性檢測人RASSF1A基因的DNA甲基化的檢測試劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性檢測人SH0X2基因的DNA 甲基化的檢測試劑是針對人SH0X2基因的引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對人 SH0X2基因中SEQIDNO:3經(jīng)亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾后的序列；或 所述的特異性檢測人RASSF1A基因的DNA甲基化的檢測試劑是針對人RASSF1A基因的 引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對人RASSF1A基因中SEQIDN0:1經(jīng)亞硫酸氫鹽 或重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾后的序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性檢測人SH0X2基因的DNA甲 基化的檢測試劑是：SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 18所示的引物以及SEQIDN0:25所示的 探針；或 所述的特異性檢測人RASSF1A基因的DNA甲基化的檢測試劑是：SEQIDNO: 7和SEQ IDNO: 10所示的引物以及SEQIDN0:22所示的探針。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括： 特異性檢測內(nèi)參基因的檢測試劑；較佳地，所述的特異性檢測內(nèi)參基因的檢測試劑是 針對人0-actin基因的引物和探針；更佳地，所述的引物和探針針對人0-actin基因中 SEQIDNO:5經(jīng)亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾后的序列；更佳地，所述的特異性檢 測內(nèi)參基因的DNA甲基化的檢測試劑是：SEQIDNO: 19和SEQIDN0:21所示的引物以及 SEQIDNO:26所示的探針。
5. 如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒，其特征在于，針對每一基因的探針連接有特定 的熒光基團；較佳地，針對人SH0X2基因的探針標記VIC熒光素，針對人RASSF1A基因的探 針標記FAM焚光素，針對人|3 -actin基因的探針標記CY5焚光素。
6. 如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中，針對人SH0X2基因的 弓丨物和探針的比例為：〇. 2 :0. 06 ;或 該試劑盒中，針對人RASSF1A基因的引物和探針的比例為：0.2 :0.06 ;或 該試劑盒中，針對人0-actin基因的引物和探針的比例為：0.67 :0. 02。
7. 權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中，還包括：DNA聚合酶、 dNTPs、Mg2+離子或包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+離子的PCR體系； 較佳地，所述的包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+離子的PCR體系中，所述的Mg2+離子濃度 為3. 5±0. 5mM;或所述的dNTPs濃度為0. 25±0. 3mM;或所述的DNA聚合酶為I. 5±0. 2U; 較佳地，所述的試劑盒中還包括：亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽。
8. 特異性檢測人SH0X2基因和人RASSF1A基因的DNA甲基化的試劑的用途，用于制備 檢測肺癌的試劑盒。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特異性檢測人SH0X2基因的DNA甲基 化的檢測試劑是針對人SH0X2基因的引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對人SH0X2 基因中SEQIDN0:3經(jīng)亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾后的序列；更佳地，所述的特 異性檢測人SH0X2基因的DNA甲基化的檢測試劑是：SEQIDNO: 14和SEQIDNO: 18所示 的引物以及SEQIDN0:25所示的探針；或 所述的特異性檢測人RASSF1A基因的DNA甲基化的檢測試劑是針對人RASSF1A基因的 引物和探針；較佳地，所述的引物和探針針對人RASSF1A基因中SEQIDN0:1經(jīng)亞硫酸氫鹽 或重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾后的序列；更佳地，所述的特異性檢測人RASSF1A基因的DNA甲 基化的檢測試劑是：SEQIDN0:7和SEQIDNO: 10所示的引物以及SEQIDN0:22所示的 探針。
10. -種體外非診斷性地檢測人SH0X2基因和人RASSF1A基因的DNA甲基化的方法，其 特征在于，所述方法包括： (1) 將待測樣品進行亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或肼鹽處理，獲得經(jīng)修飾的待測樣 品； (2) 利用權(quán)利要求1-7任一所述的用于檢測肺癌的試劑盒對步驟（1)的經(jīng)修飾的待測 樣品進行檢測，獲得人SH0X2基因的DNA甲基化情況和人RASSF1A基因的DNA甲基化情況。
【專利摘要】本發(fā)明涉及診斷人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和試劑盒。首次揭示一種通過協(xié)同檢測兩種肺癌標志物的甲基化DNA來診斷肺癌、提高肺癌檢出率的方法，所述的肺癌標志物是人SHOX2基因和人RASSF1A基因。本發(fā)明還提供了優(yōu)化的檢測SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化DNA的試劑、檢測方法。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104774957
【申請?zhí)枴緾N201510203539
【發(fā)明人】王方金, 陳靜文, 姚見兒
【申請人】上海透景生命科技股份有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月24日