用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞的cd133適配子的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)和通過引用并入
[0002] 本文所引用或參考的所有文件，以及本文所引文件中引用或參考的所有文件，連 同本文或通過引用并入本文的任何文件中提及的任何產(chǎn)品的任何制造商的指導(dǎo)、說明、產(chǎn) 品說明書和產(chǎn)品手冊(cè)，均通過引用整體并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及RNA適配子及其應(yīng)用，具體而言，涉及能特異性結(jié)合⑶133并顯示優(yōu)良 腫瘤穿透力的適配子。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 0)133,也稱為Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜（pentaspan)膜糖蛋白，其 與質(zhì)膜中的膽固醇結(jié)合。盡管已知該蛋白能夠確定大量的細(xì)胞群體，包括成體干細(xì)胞和祖 細(xì)胞，并且在多種發(fā)育的上皮細(xì)胞和分化細(xì)胞中表達(dá)，但其具體功能仍有待闡述。然而，其 與Notch-信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，該通路對(duì)二元細(xì)胞命運(yùn)、腸上皮細(xì)胞的分化和淋巴組織生成至 關(guān)重要（Ulasovetal. 2011.MolMed17:103-12)。由于認(rèn)為該分子是許多癌癥中的癌癥 干細(xì)胞（CSC)的標(biāo)志物，最近對(duì)其表現(xiàn)出了更多的興趣。確實(shí)，越來越多的證據(jù)表明CD133 在許多癌癥中的CSC上表達(dá)，并且在免疫缺陷小鼠中，相對(duì)于陰性對(duì)照物，CD133+細(xì)胞存在 增加的腫瘤發(fā)生可能性?ittfeldetal. 2009.RadiotherOncol92:353-61)。
[0006] 近些年，免疫療法對(duì)癌癥治療具有很大的影響。然而，抗體，甚至是人源化抗體 的使用，可引起不良的可能致命的副作用（Hanseletal. 2010.NatRevDrugDiscov 9:325-38)。這引起了對(duì)"更大和更好的"選擇的探索。已進(jìn)行了數(shù)次嘗試來使用核酸作為治 療劑，但這些嘗試取得了令人失望的結(jié)果，這尤其是因?yàn)檫@些核酸不能進(jìn)入細(xì)胞（Shigdar etal. 2011.BrJHaematol155:3-13)。
[0007] 化學(xué)抗體，稱為適配子，在過去20年中被越來越多地用于臨床應(yīng)用。確實(shí)，一種適 配子--哌加他尼（pegaptanib)(抗VEGF適配子）已得到FDA批準(zhǔn)，并且?guī)追N其他的適配 子在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。將適配子用于治療的增加的興趣是由于幾個(gè)原因，包括如下事實(shí)：它們 沒有表現(xiàn)出免疫原性、由于是化學(xué)合成的而產(chǎn)生的很小的批次間差異，以及相比常規(guī)抗體 更為穩(wěn)定。由于其尺寸較小，它們還顯示優(yōu)良的腫瘤穿透力。然而，它們最重要的特征是能 夠?qū)⑦@些適配子與納米粒子、藥物、顯像劑或其他核酸治療劑結(jié)合，而無功能喪失（Menget al.2012.PLoSOne7:e33434)。該功能化引起新的和更多的靶向治療，其相比當(dāng)前的治療 方式具有更少的副作用（Mengetal. 2012同上）。當(dāng)相比主要為被動(dòng)過程的常規(guī)治療時(shí)， 靶向遞送系統(tǒng)要有效得多。對(duì)于成為有效的藥物遞送劑的適配子，該適配子必須能結(jié)合其 細(xì)胞表面上的靶標(biāo)，并在短時(shí)間內(nèi)被內(nèi)化。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 最近已了解到癌癥干細(xì)胞是引起腫瘤組織形成和生長(zhǎng)的原因，并且其天然耐受化 學(xué)治療，這解釋了為何傳統(tǒng)化療起初能夠減少腫瘤但不能完全根除腫瘤，導(dǎo)致最后的復(fù)發(fā)。 根據(jù)癌癥干細(xì)胞假說，CD133陽性細(xì)胞決定長(zhǎng)期的腫瘤生長(zhǎng)，并因此被懷疑能影響臨床結(jié) 果。最近發(fā)現(xiàn)⑶133陽性細(xì)胞的比例以及它們的成簇拓?fù)浣M織均為不良的無進(jìn)展生存和總 體生存的重要預(yù)后因素，而與腫瘤階段、切除程度或患者年齡無關(guān)。
[0010] 當(dāng)前的用于檢測(cè)和靶向⑶133陽性癌癥干細(xì)胞的組織病理學(xué)技術(shù)利用常規(guī)的基 于抗體的系統(tǒng)，但由于可用的抗CD133抗體的尺寸以及它們相對(duì)不能穿透組織而缺少靈敏 性。
[0011] 因此，針對(duì)⑶133+細(xì)胞的適配子的產(chǎn)生將有利于根除癌癥。本發(fā)明人制備了⑶133 特異性的適配子，其能被快速內(nèi)化并顯示優(yōu)良的腫瘤穿透力，從而解決了這一問題。
[0012] 本公開提供了分離的RNA適配子，其能特異性結(jié)合⑶133。在一個(gè)實(shí)例中，⑶133 為人CD133。
[0013] 在一個(gè)實(shí)例中，本公開的適配子對(duì)表達(dá)于HT-29細(xì)胞上的⑶133具有的解離常數(shù) 范圍為82-145nM。在另一個(gè)實(shí)例中，本公開的適配子對(duì)表達(dá)于Hep3B細(xì)胞上的⑶133具有 的解離常數(shù)范圍為32-52nM。
[0014] 在一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含共有序列5' -CCCUCCUACAUAGGG-3'（SEQID N0:1)〇
[0015] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含選自以下的序列：
[0016] (i)5'-GAGACAAGAAUAAACGCUCAACCCACCCUCCUACAUAGGGAGGAACGA GUUACUAUAGAGCUUCGACAGGAGGCUCACAAC-3'（SEQIDN0:2);
[0017] (ii)5'-GAGACAAGAAUAAACGCUCMCCCACCCUCCUACAUAGGGAGGAACGA GUUACUAUAG-3'（SEQIDNO:3);
[0018] (iii)5'-GCUCMCCCACCCUCCUACAUAGGGAGGAACGA⑶-3'（SEQIDNO:4);
[0019] (iv)5,-CCACCCUCCUACAUAGG⑶GG_3'（SEQIDN0:5);和
[0020] (v)5,-CCCUCCUACAUAGGG-3'（SEQIDN0:1) 〇
[0021] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含共有序列5'_ CAGAACGUAUACUAUUCUG-3,（SEQIDN0:6)。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含共有序列5' -AGAACGUAUACUAUU-3'（SEQ IDNO:7).
[0023] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含序列5'-GAGACAAGAAUAAACGCUCAA GGAMGCGCUUAUUGUUUGCUAUGUUAGAACGUAUACUAUUUCGACAGGAGGCUCACAAC AGGC-3'（SEQIDNO:8)。
[0024] 在具體的實(shí)例中，本公開提供了分離的RNA適配子，其經(jīng)2' -氟-嘧啶修飾，并能 夠特異性結(jié)合⑶133。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子基本上由SEQIDN0:1或SEQIDN0:6所示 的序列組成。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子由SEQIDN0:1或SEQIDN0:6所示的序列 組成。
[0027]在另一個(gè)實(shí)例中，分離的RNA適配子包含共有序列CCCUCCUACAUAGGG(SEQ IDN0:1)，或共有序列CAGAACGUAUACUAUUCUG(SEQIDN0:6)，或共有序列 AGAACGUAUACUAUU(SEQIDN0:7)，其中序列長(zhǎng)度為15個(gè)堿基至100個(gè)堿基。在另一個(gè)實(shí)例 中，長(zhǎng)度為15-40個(gè)堿基。在另一個(gè)實(shí)例中，序列長(zhǎng)度為19個(gè)堿基至100個(gè)堿基。在其他 實(shí)例中，長(zhǎng)度為19-40個(gè)堿基。
[0028] 所述序列在共有序列中可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其保留了適配子的結(jié)合 環(huán)。在一個(gè)實(shí)例中，所述序列在共有序列中包含一個(gè)或多個(gè)取代。在一個(gè)實(shí)例中，所述序列 在共有序列中包含至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)取代。在另一個(gè)實(shí)例中，所述序列 在SEQIDNO: 1或SEQIDN0:6所示的適配子的莖區(qū)內(nèi)包含至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè) 或6個(gè)取代。在一個(gè)實(shí)例中，所述莖區(qū)為預(yù)測(cè)的適配子的二維結(jié)構(gòu)的莖區(qū)。
[0029] 在一個(gè)實(shí)例中，所述適配子包含一個(gè)或多個(gè)修飾（經(jīng)修飾的適配子），其能改善適 配子的穩(wěn)定性（體外或體內(nèi)）。合適的修飾在本文其他地方有論述。在一個(gè)實(shí)例中，嘧啶堿 基經(jīng)2' -氟代（2' -F)修飾。在另一個(gè)實(shí)例中，RNA適配子的3'端經(jīng)修飾以防止其被核酸 酶消化。在另一個(gè)實(shí)例中，適配子通過將5'端與熒光團(tuán)或反向的dT結(jié)合而被修飾。
[0030] 本公開還提供了分離的RNA適配子，其與包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:6或SEQ IDN0:7所示的序列的適配子具有基本上相同的結(jié)合⑶133的能力。
[0031] 在一個(gè)實(shí)例中，所述適配子能特異性結(jié)合⑶133+細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，所述 CD133+細(xì)胞為干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，所述干細(xì)胞為分離的癌癥干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例 中，所述癌癥干細(xì)胞特征在于：（i)表達(dá)CD133,（ii)為致瘤性的，（iii)能夠自我更新，（iv) 能夠分化，并且（v)耐受常規(guī)治療引起的細(xì)胞凋亡。
[0032] 癌癥干細(xì)胞可替代性地描述為從諸如生物樣品的來源分離的、富集的或純化的。 在另一個(gè)實(shí)例中，癌癥干細(xì)胞表示基于CD133+表達(dá)富集的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)例中，所述 細(xì)胞群包含至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的癌癥干細(xì)胞。
[0033] 在一個(gè)實(shí)例中，表達(dá)⑶133的細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞存在于體內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)例 中，表達(dá)CD133的細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞存在于體外。在其他的實(shí)例中，表達(dá)C133的細(xì)胞 和/或癌癥干細(xì)胞存在于獲自個(gè)體的生物樣品中。
[0034] 在另一個(gè)實(shí)例中，本公開的表達(dá)⑶133的細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞可表達(dá)一種或多 種其他的抗原，包括CD44、ABCG2、0 -連環(huán)蛋白、CD117、ALDH、VLA-2、CD166、CD201、IGFR、 EpCAM和EGF1R。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本公開的癌癥干細(xì)胞為腦癌干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞、前列腺 癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞、結(jié)腸癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞、卵巢癌干細(xì)胞、皮膚癌 干細(xì)胞或黑素瘤干細(xì)胞。
[0036] 本公開還提供了包含本文所述的RNA適配子的診斷劑。
[0037] 在一個(gè)實(shí)例中，所述診斷劑包含與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的本公開的RNA適配子。
[0038] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的適配子避免可能與非特異性抗體結(jié)合有關(guān)的并 發(fā)癥，并因此提供優(yōu)良的信噪比。
[0039] 在一個(gè)實(shí)例中，本文所述的診斷劑被用于在體內(nèi)或體外檢測(cè)表達(dá)CD133的癌癥干 細(xì)胞。
[0040] 在一個(gè)實(shí)例中，本公開的RNA適配子在診斷上可用于檢測(cè)個(gè)體或獲自患有腫瘤或 疑似患有腫瘤的個(gè)體的生物樣品中的表達(dá)CD133的細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞的存在?？赏ㄟ^ 將所述適配子與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合來促進(jìn)檢測(cè)?？蓹z測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物 質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、電子致密標(biāo)記、MRI標(biāo)記和放射性物質(zhì)。
[0041] 本公開還提供了用于生物樣品的組織學(xué)檢查的如本文所述的RNA適配子或如本 文所述的診斷劑。制備組織學(xué)制品的方法將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。
[0042] 本公開還提供了包含如本文所述的RNA適配子的抗癌劑。
[0043] 在一個(gè)實(shí)例中，所述抗癌劑包含與部分結(jié)合的本公開的RNA適配子。
[0044] 在一個(gè)實(shí)例中，如本文所述的抗癌劑被用于治療個(gè)體的癌癥。在一個(gè)實(shí)例中，所述 個(gè)體為將從以本公開的RNA適配子進(jìn)行治療獲益的個(gè)體。在另一個(gè)實(shí)例中，所述個(gè)體為被 診斷為患有癌癥的個(gè)體。在其他的實(shí)例中，所述個(gè)體為患有選自以下的癌癥的個(gè)體：腦癌、 乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮膚癌、黑素瘤或其中存在CD133+ 細(xì)胞的任何其他癌癥。
[0045] 可將本公開的適配子與部分結(jié)合，并且所述適配子被用于將所述部分引導(dǎo)至腫瘤 位點(diǎn)，所述腫瘤位點(diǎn)包含或疑似包含表達(dá)CD133的癌癥干細(xì)胞。部分的實(shí)例包括可被用于 殺傷癌癥干細(xì)胞的毒素、放射性核素或化療劑，或者可被用于定位以及確定包含表達(dá)CD133 的細(xì)胞的腫瘤的大小的顯像劑。
[0046] 包含本公開的RNA適配子的抗癌劑可另外包含一種或多種有效成分。
[0047] 本公開還提供了從獲自個(gè)體的生物樣品分離、純化或富集表達(dá)CD133的細(xì)胞和/ 或癌癥干細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與本公開的RNA適配子或本公開的診斷劑 接觸。在一個(gè)實(shí)例中，所述方法在體外進(jìn)行。
[0048] 分離、純化或富集表達(dá)⑶133的細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且也在本 文其他地方有描述。
[0049] 本公開還提供了確定個(gè)體或獲自患有或疑似患有癌癥的個(gè)體的生物樣品中的表 達(dá)CD133的細(xì)胞和/或癌癥干細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與本公開的分離的RNA 適配子或本公開的診斷劑接觸。
[0050] 本公開還提供了治療或預(yù)防個(gè)體中的癌癥的方法，包括向個(gè)體提供本文所述的RNA適配子或本文所述的抗癌劑。
[0051] 在一個(gè)實(shí)例中，所述癌癥為其中存在或疑似存在表達(dá)CD133的細(xì)胞和/或癌癥干 細(xì)胞的任何癌癥。在另一個(gè)實(shí)例中，所述個(gè)體為已被診斷為患有癌癥的個(gè)體。在其他的實(shí) 例中，所述個(gè)體為患有選自以下的癌癥的個(gè)體：腦癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝 癌、肺癌、卵巢癌、皮膚癌、黑素瘤或其中存在CD133+細(xì)胞的任何其他癌癥。
[0052] 本公開還涉及如本文所述的RNA適配子或抗癌劑在藥物中的應(yīng)用。
[0053] 本公開還涉及如本文所述的RNA適配子或抗癌劑用于治療或預(yù)防個(gè)體中的癌癥 的用途。
[0054] 本公開還涉及如本文所述的RNA適配子或抗癌劑在制備用于治療或預(yù)防個(gè)體中 的癌癥的藥物中的用途。
[0055] 本發(fā)明還涉及包含與siRNA或核酶結(jié)合的如本文所述的RNA適配子的遞送劑。
[0056] 本公開還提供了包含治療有效量的如本文所述的RNA適配子、抗癌劑或遞送劑， 以及藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的組合物。
[0057] 本公開還提供了用于腫瘤的分子成像的如本文所述的RNA適配子或如本文所述 的診斷劑。
[0058] 本發(fā)明的RNA適配子的腫瘤穿透能力提供了相比用于腫瘤的分子成像的抗體的 獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。例如，可將所述RNA適配子與能夠促進(jìn)攜帶表達(dá)CD133的細(xì)胞的腫瘤的檢測(cè)和 成像的試劑結(jié)合。合適的試劑的實(shí)例包括如本文所述的檢測(cè)標(biāo)記。
[0059] 如本文所述的RNA適配子、診斷劑、抗癌劑、遞送劑或藥物組合物可單獨(dú)使用，或 與其他治療形式組合使用。例如，RNA適配子、診斷劑、抗癌劑、遞送劑或藥物組合物可與化 療和/或放療組合使用。雖然不希望受到理論的束縛，假定化療劑或放療劑可通過主要靶 向通常為癌癥干細(xì)胞的后代細(xì)胞的快速分裂細(xì)胞用于減小腫瘤。所述診斷劑可通過檢測(cè)腫 瘤中的癌癥干細(xì)胞的存在或缺乏，用于確定任何先前的治療形式清除癌癥干細(xì)胞的效果。 然后，可將包含本公開的RNA適配子的抗癌劑、遞送劑或藥物組合物給予腫瘤位點(diǎn)，以特異 性減少癌癥干細(xì)胞。因此，包含RNA適配子的抗癌劑、遞送劑或藥物組合物可與化療或放療 一起使用，或者在化療或放療后使用。還涉及可將本公開的RNA適配子與靶向癌癥干細(xì)胞 上存在的抗原的一種或多種其他的適配子組合。