[0060] 應(yīng)理解，本公開的每個實例加上必要的變更適用于治療、預(yù)防或改善個體中的癌 癥的方法。
[0061] 應(yīng)理解，本公開的每個實例加上必要的變更適用于腫瘤的分子成像。
【附圖說明】
[0062]圖 1.RNA適配子的序列；15merCD133RNA適配子，指定為CD133-l-2-2(SEQID N0:1);以及 19merCD133RNA適配子，指定為CD133-2-l(SEQIDN0:6)〇
[0063] 堿基修飾：2' -F-嘧啶RNA，胞苷（C)和尿苷（U)為2' -F修飾的（參見圖中有下 劃線的）。IDT-3'用于保護其不被核酸酶消化。RNAHPLC級純化，合成后：2'_去保護/脫 鹽。
[0064] 圖2.使用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX)分離⑶133適配子。
[0065] (A)來自重復(fù)循環(huán)的SELEX的FITC標(biāo)記的適配子與⑶133轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的 結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析。將來自每輪的熒光素標(biāo)記的RNA與靶標(biāo)細(xì)胞在37°C下孵育30分 鐘，然后進行流式細(xì)胞術(shù)分析。（B)在減去未經(jīng)挑選的文庫RNA與靶細(xì)胞的結(jié)合的平均熒光 強度以及與陰性對照細(xì)胞結(jié)合的平均熒光強度后，計算每輪的結(jié)合。R，SELEX循環(huán)的輪；R， 未經(jīng)挑選的隨機文庫。
[0066] 圖3.截短的⑶133適配子克隆的相互作用的平衡解離常數(shù)（KD)的測定。
[0067] 5X105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度、不同濃度的⑶133適配子（l-200nM)下的代表性 結(jié)合曲線。（A)HT-29 細(xì)胞；（B)Hep3B細(xì)胞；（C)T98G細(xì)胞；（D)HEK293T細(xì)胞。
[0068] 圖4⑶133適配子的截短。
[0069] (A)CD133-1 被連續(xù)總共截短 4 次，（i) :CD133-1 ;(ii) :CD133-1-1， (iii) :CD133-l-2，（iv) :CD133-l-2-l，（v) :CD133-l-2-2 ;(B) (i)CD133-2 被截短一次， (ii)CD133-2-l〇
[0070] 圖5.⑶133適配子在與⑶133陽性細(xì)胞而非⑶133陰性細(xì)胞結(jié)合后被內(nèi)吞。
[0071] 37°C下將DY647標(biāo)記的⑶133適配子與所示的癌細(xì)胞孵育30min，然后使用激光掃 描共聚焦顯微鏡成像。對于每對圖，光學(xué)（相位）圖像在上方，熒光圖像在下方。HT-29和 Ifep3B分別為表達⑶133的人結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。T98G為不表達⑶133的人膠質(zhì)瘤細(xì) 胞。HEK293T為不表達⑶133的人非腫瘤細(xì)胞系。標(biāo)度線-20ym。
[0072] 圖6.⑶133適配子在與⑶133陽性細(xì)胞而非⑶133陰性細(xì)胞結(jié)合后被內(nèi)吞。
[0073] 在阻止內(nèi)吞的處理（去鉀）后，適配子不再進入細(xì)胞，相反，它們停留在細(xì)胞表面 (形成環(huán)形結(jié)構(gòu)而非顆粒模式）。轉(zhuǎn)鐵蛋白被用作陽性對照以顯示阻止轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞的處 理的效力。HT-29:結(jié)腸癌細(xì)胞系，H印3B:人肝癌細(xì)胞系。37°C下將DY647標(biāo)記的CD133適 配子與所示的癌細(xì)胞孵育30min，然后使用激光掃描共聚焦顯微鏡進行成像。對于每對圖， 光學(xué)（相位）圖像在上方，而熒光圖像在下方。標(biāo)度線-20ym。
[0074] 圖7⑶133RNA適配子相比⑶133抗體（AC133)更好地穿透腫瘤塊。
[0075] 在補充有成纖維細(xì)胞生長因子（10ng/ml)和表皮生長因子（10ng/ml)、胰島素 (50yg/ml)和B27 (100單位/ml)的無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)CD133+人結(jié)腸癌細(xì)胞 (HT-29)和CD133-人腎上皮細(xì)胞（HEK293T)，以允許形成腫瘤球體。當(dāng)球體達到300ym的 大小時，分別以l〇〇nMDy647標(biāo)記的⑶133RNA適配子或?qū)φ者m配子以及等濃度的PE-⑶133 抗體（AC133)孵育球體4hr。在使用PBS洗滌3次后，使用共聚焦熒光顯微鏡對球體成像。 顯示了兩個核心（中間）部分。
[0076] 序列表要點
[0077]SEQIDN0:1:是CD133-2-2 適配子的序列（15mer)
[0078]SEQIDN0:2:是CD133-1 適配子的序列（81mer)
[0079]SEQIDN0:3:是CD133-1-1 適配子的序列（58mer)
[0080]SEQIDN0:4:是CD133-1-2 適配子的序列（35mer)
[0081]SEQIDN0:5:是CD133-1-2-1 適配子的序列（21mer)
[0082]SEQIDN0:6:是CD133-2-1 適配子的序列（19mer)
[0083]SEQIDNO:7:是CD1：33 適配子的共有序列（ISmer)
[0084]SEQIDN0:8:是CD133-2 適配子的序列（85mer)
[0085] 發(fā)明詳述
[0086] 通用摶術(shù)和所詵宙義
[0087] 術(shù)語"和/或"，例如"X和/或Y"，應(yīng)理解為是指"X和Y"或者"X或Y"，并且應(yīng)當(dāng) 理解為提供了對兩種含義或其中的一種含義的明確支持。
[0088] 本公開中包括的任何文獻、行為、材料、裝置、物品等的論述不應(yīng)理解為承認(rèn)這些 事物中的任一種或所有這些事物形成了現(xiàn)有技術(shù)的一部分，或者由于其出現(xiàn)于本申請的每 項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前而為與本公開相關(guān)的領(lǐng)域中的公共常識。
[0089] 在整個本說明書中，除非明確地另有所述，或者上下文另有要求，提及單個步驟、 組合物、步驟組合或者組合物組合應(yīng)當(dāng)理解為包括這些步驟、組合物、步驟組合或者組合物 組合中的一項和多項（即，一項或多項）。
[0090] 除非明確另有所述，本文中描述的每個實例加以必要的修改適用于本公開的其他 實例中的每一個。
[0091] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本公開易于進行除明確描述的那些外的改變和修改。應(yīng)理 解，本公開包括所有這樣的改變和修改。本公開還包括本說明書中單獨或共同提及或指出 的步驟、特征、組合物和化合物的全部，以及所述步驟或特征的任何和全部組合或者任何兩 項或更多項。
[0092] 本公開的范圍并不限于本文中描述的具體實例，這些具體實例僅旨在示例的目 的。功能等同的產(chǎn)品、組合物和方法顯然位于本公開的范圍中。
[0093] 不需要過多的實驗，除非另有所示，使用分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、細(xì) 胞生物學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)即可實施本公開內(nèi)容。此類方案描述于，例如， Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold SpringHarborLaboratories，NewYork，第二版（1989)，第I、II和III卷全卷； DNACloning:APracticalApproach，第I和II卷（D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press,Oxford,整篇文檔；OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(M. J.Gait，ed，1984)IRLPress，Oxford，整篇文檔，且尤其是其中的Gait的文 章，ppl-22;Atkinsonetal，pp35_81;Sproatetal，pp83-115 ;以及Wuetal，pp 135-151 ；4.NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(B.D.Hames&S. J.Higgins，eds.，1985)IRLPress，Oxford，整篇文檔；ImmobilizedCellsandenzymes:A PracticalApproach(1986)IRLPress，0xford，整篇文檔；Perbal，B.，APractical GuidetoMolecularCloning(1984)；MethodsInEnzymology(S.Colowickand N.Kaplan，eds.，AcademicPress，Inc.)，整篇文檔，Sakakibara，D.，Teichman，J.，Lien，E. LandFenichel,R.L. (1976).Biochem.Biophys.Res.Commun. 73336-342 ；Merrifield,R. B. (1963).J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-2154 ；Barany,G.andMerrifield,R.B. (1979)inThe Peptides(Gross,E.andMeienhofer,J.eds. ),vol. 2,pp. 1-284,AcademicPress,New York. 12.Wlinsch,E. ,ed. (1974)SynthesevonPeptideninHouben-WeylsMetodender OrganischenChemie(Mliler，E.，ed. )，vol. 15，第4版?，第 1和2部分，Thieme，Stuttgart; Bodanszky,M. (1984)PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelbe rg；Bodanszky,M. &Bodanszky,A. (1984)ThePracticeofPeptideSynthesis,Springe r-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M. (1985)Int.J.PeptideProteinRes. 25, 449-474 ； HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds ?，1986,BlackwellScientificPublications);以及AnimalCellCulture:Practical Approach，第 3 版（JohnR.W.Masters，ed.，2000)，ISBN0199637970,整篇文檔。
[0094] 在整個本說明書中，除非上下文另有要求，詞語"包含（comprise)"或者變型如 "包含（comprises) "或"包含（comprising) "應(yīng)理解為意指包括所述的步驟或元件或整數(shù)， 或者步驟或元件或整數(shù)的組合，但不排除任何其他的步驟或元件或整數(shù)，或者元件或整數(shù) 的組合。
[0095] 術(shù)語"由…組成（consistsof/consistingof) "應(yīng)理解為意指方法、過程或組合 物具有所述的步驟和/或組分，并且沒有其他的步驟或組分。
[0096] 如本文所用，術(shù)語"約"在涉及可測量的值如重量、時間、劑量等的量時，是指包括 與所示量的± 20 %或± 10 %，更優(yōu)選± 5 %，甚至更優(yōu)選± 1 %，并且甚至更優(yōu)選± 0. 1 %的 差異，因為這樣的差異適合實施所公開的方法。
[0097] 如本文所用的術(shù)語"適配子"一般是指單個定義的序列的寡核苷酸，或者所述寡核 苷酸的混合物，其中所述混合物保留了對CD133的結(jié)合特異性。如本文所用，"適配子"是指 單鏈核酸。在結(jié)構(gòu)上，本公開的適配子為特異性結(jié)合性寡核苷酸。
[0098] 如本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"通用于多脫氧核糖核苷酸（含有2'-脫氧-D-核 糖或其經(jīng)修飾的形式），即DNA;多核糖核苷酸（含有D核糖或其經(jīng)修飾的形式），即RNA; 以及任何其他類型的多核苷酸，其為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷，或者經(jīng)修飾的嘌 呤或嘧啶堿基或無堿基核苷酸。根據(jù)本公開的內(nèi)容，術(shù)語"寡核苷酸"不僅包括具有常規(guī)堿 基、糖殘基和核苷酸間連接的那些，還包括包含這3個部分中的任何一個或所有這3個部分 的修飾的那些。
[0099] 如本文所用的術(shù)語"RNA適配子"是包含核糖核苷單元的適配子。RNA適配子還意 在包括如本文所定義的RNA類似物。
[0100] 如本文所用，術(shù)語"結(jié)合親和力"和"結(jié)合活性"意在指配體分子/適配子結(jié)合或不 結(jié)合靶標(biāo)的傾向，并且描述了配體分子/適配子結(jié)合靶標(biāo)的結(jié)合強度或親和力的度量。所 述相互作用的能量學(xué)在"結(jié)合活性"和"結(jié)合親和力"上是有意義的，因為其確定了相互作用 伴侶的必要濃度、這些伴侶能夠結(jié)合的速率，以及溶液中結(jié)合和游離分子的相對濃度。所述 能量學(xué)在本文中是通過測定解離常數(shù)Kd(以及其他方式）來表征的。如本領(lǐng)域所已知的，低 的解離常數(shù)指示分子彼此間的較強的結(jié)合和親和力。在一個實例中，解離常數(shù)為至少i〇_6m。 在另一個實例中，解離常數(shù)為至少1(T8和1(T9M。
[0101] 如本文中所用，術(shù)語"生物樣品"是指來自個體的細(xì)胞或細(xì)胞群或一定量的組織或 流體。最經(jīng)常情況下，所述樣品已被從個體移除，但術(shù)語"生物樣品"也可指體內(nèi)分析的細(xì) 胞或組織，即未從個體移除的細(xì)胞或組織。通常，"生物樣品"包含來自個體的細(xì)胞，但該術(shù) 語也可指可用于測量基因表達水平的非細(xì)胞的生物物質(zhì)，如血液、唾液或尿液的非細(xì)胞部 分。生物樣品包括但不限于組織活檢、穿刺活檢、刮擦物（例如，口腔刮擦物）、全血、血漿、 血清、淋巴、骨髓、尿液、唾液、痰、細(xì)胞培養(yǎng)物、胸膜液、心包液、腹水或腦脊液。生物樣品還 包括組織活檢和細(xì)胞培養(yǎng)物。生物樣品或組織樣品可指分離自個體的組織或流體樣品，包 括但不限于，例如，血液、血漿、血清、腫瘤活檢、尿液、糞便、痰、脊髓液、胸膜液、乳頭吸液、 淋巴液、皮膚的外部部分、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、淚液、唾液、奶、細(xì)胞（包括但不限于 血細(xì)胞）、腫瘤、器官，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)物組分樣品。在一些實施方案中，樣品來自原發(fā)性 或轉(zhuǎn)移性腫瘤的切除術(shù)、支氣管鏡活檢或芯針活檢，或者來自胸膜液的單元塊。另外，可使 用細(xì)針吸入樣品。樣品可為石蠟包埋的或冷凍的樣品?？赏ㄟ^從個體去除細(xì)胞樣品獲得樣 品，但也可通過使用先前分離的細(xì)胞（例如，另一個人分離的）完成，或者通過體內(nèi)實施本 發(fā)明的方法。
[0102] 如本文所用的術(shù)語"與…結(jié)合"意在包括RNA適配子借以與本文描述的檢測劑、部 分、siRNA或核酶連接、貼附或接合的任何結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生結(jié)合的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知， 并且包括但不限于通過肽接頭或通過將RNA和試劑（例如，siRNA或核酶）直接化學(xué)合成 為一整條鏈的綴合、連接。
[0103] 如本文所用的術(shù)語"分離的"意在指可從其他組分分離的或從其他組分純化的RNA 適配子或干細(xì)胞（例如，癌癥干細(xì)胞）。分離的細(xì)胞是指來自其可能天然存在的環(huán)境中的細(xì) 胞。分離的細(xì)胞可被純化至相對于其可天然獲取的狀態(tài)的任何程度。
[0104] 如本文所用的術(shù)語"配體"是指具有結(jié)合靶標(biāo)能力的分子或其他化學(xué)實體。配體 可包括肽、寡聚物、核酸（例如，適配子）、小分子（例如，化合物）、抗體或其片段、核酸-蛋 白融合物和/或任何其他的親和試劑。因此，配體可來自任何來源，包括文庫，特別是組合 文庫，如下文公開的適配子文庫、噬菌體展示文庫或在本領(lǐng)域技術(shù)人員研宄本公開內(nèi)容后