顯而易見的任何其他的文庫。
[0105] 如本文所用的術(shù)語"修飾的RNA適配子"意指多聚分子，其除了包含核糖核苷作 為其單元外，還包含以下中的至少一種：2' -脫氧、2' -鹵代（包括2' -氟代）、2' -氨基 (優(yōu)選為未取代的或單取代的或雙取代的）、2' -單鹵代甲基、二鹵代甲基或三鹵代甲基、 2' -0-烷基、2' -0-鹵代-取代的烷基、2'-烷基、疊氮基、硫代磷酸、巰基、甲基膦酸酯、 熒光素、若丹明、芘、生物素、黃嘌呤、次黃嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、2-羥基-6-巰嘌呤和在第 6位被硫取代或者在第5位被鹵素或Ci_5烷基取代的嘧啶堿基、非堿基接頭、3'-脫氧-腺 苷以及其他可用的"鏈終止子"或"不可延展的"類似物（在RNA的3'端），或標記物如32P、 33P等?？墒褂帽疚墓_的標準合成技術(shù)將所有上述基團摻入至RNA中。
[0106] 如本文所用，術(shù)語"治療有效量"應理解為指足夠量的用于減少或抑制表達⑶133 的癌癥干細胞的數(shù)目和/或癌癥的一種或多種癥狀的根據(jù)本公開的RNA適配子、抗癌劑、遞 送劑或藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這樣的量將根據(jù)例如具體個體和/或疾病的類型 或嚴重性或水平而改變。該術(shù)語不應理解為將本公開限定于特定量的RNA適配子。
[0107] 如本文所用，術(shù)語"治療（treat/treatment/treating) "應理解為指給予治療有效 量的如本文所公開的RNA適配子、抗癌劑、遞送劑或藥物組合物，并減輕或抑制與癌癥相關(guān) 的或由癌癥引起的臨床病況的至少一種癥狀。
[0108] 如本文所用，術(shù)語"預防（prevent/preventing/prevention) "應理解為指給予治 療有效量的根據(jù)本公開的RNA適配子、抗癌劑、遞送劑或藥物組合物，并阻止或妨礙或延遲 癌癥的至少一種癥狀的發(fā)展或進展。
[0109] 如本文所用，術(shù)語"特異性結(jié)合"應理解為指相比其與替選細胞或物質(zhì)的反應或結(jié) 合，RNA適配子與特定細胞或物質(zhì)反應或結(jié)合得更為頻繁、更為快速、持續(xù)時間更長和/或 親和力更大。例如，相比其結(jié)合不相關(guān)的蛋白和/或表位或它們的免疫原性片段，特異性結(jié) 合靶標蛋白的RNA適配以更大的親和力、親合力、更快速地和/或以更長的持續(xù)時間結(jié)合該 蛋白或表位或它們的免疫原性片段。通過閱讀本定義，還應理解，例如，特異性結(jié)合第一靶 標的RNA適配子可以或不可以特異性結(jié)合第二靶標。由此，"特異性結(jié)合"未必需要排斥結(jié) 合或不可檢測地結(jié)合另一分子，這包括在術(shù)語"選擇性結(jié)合"中。通常，但非必然地，提及結(jié) 合是指特異性結(jié)合。根據(jù)相比適配子和環(huán)境中的其他物質(zhì)或總體上的非相關(guān)分子的解離常 數(shù)，適配子對靶標的比較解離常數(shù)（Kd)來定義結(jié)合的特異性。通常適配子對于靶標的Kd 為靶標和不相關(guān)物質(zhì)或環(huán)境中的伴隨物質(zhì)的Kd的1/2、1/5或1/10。甚至更優(yōu)選地，Kd為 1/50U/100 或 1/200。
[0110] 如本文所用的術(shù)語"⑶133+"或"表達⑶133的細胞"可互換使用。該術(shù)語包括可 通過任何合適的方式檢測的CD133抗原的細胞表面表達。在一個實例中，提及細胞對于給 定標志物為陽性是指其可為該標志物的低（1〇或暗）或高（亮，bri)表達者，這取決于該 標志物在細胞表面上存在的程度，其中所述術(shù)語涉及熒光強度。
[0111] 如本文所用，術(shù)語"個體"應理解為指任何個體，包括人或非人個體。非人個體可 包括非人的靈長類、有蹄類（牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛和美洲野牛）、犬、貓科動物、兔類 (家兔、野兔和鼠兔）、嚙齒類（小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠和沙鼠）、鳥和魚。在一個實例中，個 體為人。
[0112]話配子
[0113] 適配子的幾種獨特的特性使得它們成為用于大量的分子生物學應用和用作潛在 的藥劑的有吸引力的工具。首先，大多數(shù)適配子以高親和力結(jié)合靶標，顯示皮摩爾至納摩爾 范圍內(nèi)的典型的解離常數(shù)。適配子的結(jié)合位點包括靶標分子的裂縫和凹槽，引起與許多當 前可用的藥劑非常類似的拮抗活性。第二，適配子的結(jié)構(gòu)在較廣的溫度和儲存條件范圍內(nèi) 是穩(wěn)定的，保留了形成其獨特的三級結(jié)構(gòu)的能力。第三，適配子可被化學合成，這與制備單 克隆抗體所需的昂貴的和勞動密集的生物系統(tǒng)形成對比。
[0114] 不希望受到理論的束縛，由于RNA適配子對其靶標蛋白的理論上較高的親和力以 及修飾的RNA比未修飾的RNA更大的血漿穩(wěn)定性，RNA適配子通常是許多研宄小組優(yōu)選的。
[0115] 本文公開了能特異性結(jié)合CD133抗原的RNA適配子分子，其可用于在細胞內(nèi)有效 遞送siRNA或核酶、化療藥物、放射性同位素、毒素和/或其他攜帶有抗原的試劑。
[0116] 適配子為單鏈的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其結(jié)合特定的靶標分子如蛋白或小 分子。因此，適配子是抗體的寡核苷酸類似物。通常，適配子包含約15至約100個核苷酸， 優(yōu)選約15至約40個核苷酸，并且更優(yōu)選約20至約40個核苷酸，其中長度落入這些范圍中 的寡核苷酸可通過常規(guī)技術(shù)進行制備。任選地，適配子還可包含最少約6個核苷酸，優(yōu)選10 個，且更優(yōu)選14或15個核苷酸，它們?yōu)楫a(chǎn)生特異性結(jié)合所必需。如果可以在放置靶標的 環(huán)境中獲得適當?shù)南嗷プ饔?，包含短?0個，例如，6-mer的序列的結(jié)合區(qū)的適配子是可行 的。因此，如果其他物質(zhì)的干擾很小，可以要求較小的特異性和較小的結(jié)合強度。
[0117] 適配子結(jié)合高度依賴于適配子寡核苷酸形成的二級結(jié)構(gòu)。RNA和單鏈DNA(或類似 物）適配子是已知的。參見，例如Burkeetal(1996).J.Mol.Biol. 264:650-666;Ellington andSzostak(1990).Nature346:818-22；Hiraoetal(1998).MolDivers.4:75-89 ； Jaegeretal(1998).EMBOJournal17:4535；Kenschetal(2000).J.Biol.Chem 275:18271-8;Schneideretal(1995).Biochemistry34:9599-9610;以及US5773598; US6028186 ;US6110900 ;US6127119 ;和US6171795。
[0118] 話配子對給宙靶標的詵擇
[0119] 可通過使用稱為SELEX?(指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)）的迭代方法挑選結(jié)合幾 乎任何特定靶標的適配子。該方法描述于，例如US5270163和US5475096中。SELEX?方 法是基于以下獨特的觀察：核酸具有足夠的形成多種二維和三維結(jié)構(gòu)的能力，以及在其單 體中適用的充當幾乎任何化合物（不管是單體還是聚合物）的配體（即，形成特異性結(jié)合 對）的足夠的化學多功能性。任何大小或組成的分子均可用作靶標。
[0120]SELEX?方法在開始時依賴于包含隨機化序列的單鏈寡核苷酸的大文庫或庫。所述 寡核苷酸可為修飾的或未修飾的DNA、RNA或DNA/RNA雜合子。在一些實例中，所述庫包含 100 %隨機或部分隨機的寡核苷酸。在其他實例中，所述庫包含隨機的或部分隨機的寡核苷 酸，所述寡核苷酸包含摻入在隨機化序列中的至少一段固定的序列和/或保守序列。在其 他實例中，所述庫包含隨機的或部分隨機的寡核苷酸，所述寡核苷酸在其5'端和/或3' 端包含至少一段固定的序列和/或保守序列，所述序列可包含所述寡核苷酸庫的所有分子 所共有的序列。固定的序列為庫中寡核苷酸所共有的序列，其摻入是為了預選目的，如CpG 基序、PCR引物的雜交位點、RNA聚合酶的啟動子序列（例如，T3、T4、17和SP6)、限制位點 或均聚序列，如多聚A或多聚T束、催化核心、用于選擇性結(jié)合至親和柱的位點，以及其他的 有助于目標寡核苷酸的克隆和/或測序的序列。保守序列為先前描述的固定的序列以外的 能結(jié)合相同靶標的多種適配子所共有的序列。
[0121] 所述庫的寡核苷酸優(yōu)選包括隨機化的序列部分以及有效擴增所必需的固定的序 列。通常，起始庫的寡核苷酸包含固定的5'端和3'端序列，其位于30-50個隨機核苷酸的 內(nèi)部區(qū)域的側(cè)翼?？梢远喾N方式制備所述隨機化的核苷酸，包括化學合成和從隨機切割的 細胞核酸進行尺寸選擇。也可在選擇/擴增迭代之前或期間通過誘變引入或增加測試核酸 中的序列變異。
[0122] 寡核苷酸的隨機序列部分可為任何長度，并且可包含核糖核苷酸和/或脫氧核糖 核苷酸，并且可包含修飾的或非天然的核苷酸或核苷酸類似物（參見，例如US5958691、 US5660985和W0 92/07065)?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的固相寡核苷酸合成技術(shù)從磷酸二 醋連接的核苷酸合成隨機寡核苷酸。參見，例如Froehleretal.，（1986).Nucl.Acid Res. 14:5399-5467 和Froehleretal(1986)Tet.Lett. 27:5575-5578。也可使用溶液 相方法如三酯合成方法合成隨機寡核苷酸。參見，例如Soodetal(1977).Nucl.Acid Res.4:2557 和Hiroseetal(1978).Tet.Lett.，28:2449。在自動化DNA合成儀上進行的 典型合成產(chǎn)生1〇14_1〇16個個體分子，這一數(shù)字對于大多數(shù)SELEX?實驗已足夠。
[0123] 可通過在DNA合成儀上自動化化學合成來生成寡核苷酸的起始文庫?？赏ㄟ^在每 個另外的步驟中以不同的摩爾比添加4個核苷酸來生成部分隨機序列。
[0124] 寡核苷酸的起始文庫可為RNA或DNA。在將RNA文庫用作起始文庫的情況下，通常 通過在體外使用17RNA聚合酶或修飾17RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA文庫來生成RNA文庫，并進行 純化。然后，在有助于結(jié)合的條件下將RNA或DNA文庫與靶標混合，并使用相同的通用選擇 方案對其進行逐步的結(jié)合、分離和擴增重復，以達到幾乎任何所需的結(jié)合親和力和選擇性 標準。更具體而言，以包含核酸的起始庫的混合物起始，SELEX?方法包括如下步驟：(a)在 有利于結(jié)合的條件下將混合物與靶標接觸；(b)將未結(jié)合的核酸從與靶標分子特異性結(jié)合 的那些核酸中分離開來；（c)解離核酸-靶標復合物；（d)擴增從核酸-靶標復合物解離的 核酸以產(chǎn)生富集了配體的核酸混合物；以及（e)根據(jù)需要盡可能多地重復結(jié)合、分離、解離 和擴增步驟的循環(huán)，以產(chǎn)生針對靶標分子的高特異性、高親和力的核酸配體。在選擇了RNA 適配子的那些情況下，SELEX?法還包括如下步驟：（i)逆轉(zhuǎn)錄從核酸-靶標復合物解離的 核酸，然后進行步驟（d)中的擴增；以及（ii)轉(zhuǎn)錄來自步驟（d)的所擴增的核酸，然后重新 開始所述過程。
[0125] 重復選擇和擴增循環(huán)直到達到預期目標。通常，重復至直到在重復循環(huán)上得不到 結(jié)合力的顯著改善。通常，以5-20個循環(huán)程序選擇核酸適配子分子。
[0126] 已知存在多種核酸一級、二級和三級結(jié)構(gòu)。顯示最常參與非沃森-克里克類型的 相互作用的結(jié)構(gòu)或基序被稱為發(fā)夾環(huán)、對稱和非對稱凸起、假節(jié)及其眾多的組合。幾乎所有 已知的這類基序的案例表明它們可在不多于30個核苷酸的核酸序列中形成。出于這一原 因，通常優(yōu)選的是，使用連續(xù)的隨機化片段的SELEX?程序以包含約20至約50個核苷酸的 隨機化片段的核酸序列起始。
[0127] 對核心的SELEX?方法進行了修改，以實現(xiàn)許多特定目標。例如，US5707796描 述了使用SELEX?結(jié)合凝膠電泳來選擇具有特定結(jié)構(gòu)特征的核酸分子，如彎曲的DNA。US 5763177描述了基于SELEX?的方法，其被用于挑選包含能夠與靶標分子結(jié)合和/或光交聯(lián) 和/或光失活靶標分子的光反應性基團的核酸配體。US5567588和US5861254描述了基 于SELEX?的方法，其實現(xiàn)了對靶標分子具有高和低親和力的寡核苷酸之間的高效分離。US 5496938描述了在實施SELEX?過程后獲得改良的核酸配體的方法。US5705337描述了將 配體與其靶標共價連接的方法。
[0128] 反向SELEX?是通過消除與一種或多種非靶標分子交叉反應的核酸配體序列來改 善核酸配體對靶標分子的特異性的方法。反向SELEX?包括以下步驟：(a)制備候選的核 酸混合物；(b)將候選混合物與靶標接觸，其中可從剩余的候選混合物中分離相對于候選 混合物對靶標具有增加的親和力的核酸；（c)從剩余的候選混合物中分離親和力增加的核 酸；（d)從靶標中解離親和力增加的核酸；（e)將所述親和力增加的核酸與一種或多種非靶 標分子接觸，以便將對非靶標分子具有特定親和力的核酸配體去除；以及（f)擴增僅對靶 標分子具有特定親和力的核酸，以產(chǎn)生用于結(jié)合靶標分子的針對具有相對較高親和力和特 異性的核酸序列富集的核酸混合物。如上文針對SELEX?所描述的，如有必要重復選擇和擴 增循環(huán)直至達到預期目標。
[0129]在典型的實例中，使用諸如Beaucageetal. (1981)Tetrahedr. Letters22:1859-1862和Sinhaetal.，（1984)NucleosidesandNucleotides3:157-171 所描述的那些的常規(guī)技術(shù)在固相支持柱上合成RNA適配子。從產(chǎn)生的RNA適配子去除最終 的DMT基團。可選地，如果使用大規(guī)模合成，可通過擴大固相載體法規(guī)模來制備RNA適配子， 或者可通過使用溶液相技術(shù)（特別是在所需要的終產(chǎn)物為相對較短的寡核苷酸時）制備 RNA適配子。用于合成方法的起始物質(zhì)可為具有所需要的一級結(jié)構(gòu)的5'-非三苯甲基化 的RNA寡核糖-核苷酸或類似物，其優(yōu)選可具有經(jīng)保護的堿基，并且其優(yōu)選結(jié)合固相載體。 可使用任何常規(guī)使用的保護基團。通常，N6-苯甲酰基被用于腺嘌呤、N4-苯甲酰基被用于 胞嘧啶、N2-異丁?；挥糜邙B嘌呤和N2-苯甲?；挥糜?-氨基嘌呤。其他有用的保護 基團包括苯氧乙?；≒AC)和t-丁氧乙酰基（TAC)。便利地，應當將更多的堿基不穩(wěn)定性 保護基團用于合成RNA適配子；本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些基團。這樣的基團可幫助防止生 成的三磷酸或二磷酸水解，它們通常在堿性條件下非常穩(wěn)定，但能夠接受一些水解作用。其 他預期的修飾在美國專利第6, 011，020號中有公布，并且包括但不限于通過共價連接摻入 生物利用度增強分子如PEG或膽固醇。
[0130] 另外，在RNA合成期間可摻入核苷類似物如2'-脫氧、2'-鹵代、2'-氨基（未 取代的或單取代的或雙取代的）、2< -單鹵代甲基、二鹵代甲基或三鹵代甲基、2' -0-烷 基、2' -0-鹵素取代的烷基、2'-烷基、疊氮基、硫代磷酸酯、巰基、甲基膦酸酯、熒光素、若 丹明、芘、生物素、黃嘌呤、次黃嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、2-羥基-6-巰嘌呤和在第6位被硫 取代或者在第5位被鹵素或(V5烷基取代的嘧啶堿基、非堿基接頭、3'-脫氧-腺苷以及 其他可用的"鏈終止子"或"不可延展的"類似物（在RNA的3'端）等。此外，不同的標記 物如32P或33P等同樣可在合成期間摻入，產(chǎn)生新的通過該方法制備的RNA類似物。其他預 期的修飾公布于美國專利第6, 011，020號中，并且包括但不限于摻入3'帽，如反向DT帽， 或反向的非堿基帽或它們的組合。