發(fā)明詳述
[0060] 本公開提供結(jié)合多肽（例如，抗體）及其藥物偶聯(lián)物，其包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，其中所述 Fc結(jié)構(gòu)域包含：根據(jù)EU編號(hào)在氨基酸位點(diǎn)298的天冬酰胺殘基；和根據(jù)EU編號(hào)在氨基酸 位點(diǎn)300的絲氨酸或蘇氨酸殘基。本公開還提供了編碼抗原結(jié)合多肽的核酸、用于制造這 種抗原結(jié)合多肽的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。并且提供了使用本文公開的抗原結(jié)合多肽治 療疾病的方法。
[0061]I?定義
[0062] 本文所用術(shù)語"結(jié)合多肽"或"結(jié)合多肽"指包含至少一個(gè)負(fù)責(zé)與感興趣的靶抗原 (例如，人抗原）選擇性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的多肽（例如，抗體）。典型的結(jié)合位點(diǎn)包括抗體 可變結(jié)構(gòu)域、受體的配體結(jié)合位點(diǎn)或配體的受體結(jié)合位點(diǎn)。某些方面，本發(fā)明的結(jié)合多肽包 含多個(gè)（例如，二、三、四或更多）結(jié)合位點(diǎn)。
[0063] 本文所用術(shù)語"天然殘基"指在結(jié)合多肽（例如，抗體或其片段）的特定氨基酸位 點(diǎn)天然存在的并未通過人工進(jìn)行修飾、引入或改變的氨基酸殘基。本文所用術(shù)語"改變的結(jié) 合多肽"或"改變的結(jié)合多肽"包括包含至少一個(gè)非天然的突變氨基酸殘基的結(jié)合多肽（例 如，抗體或其片段）。
[0064] 本文使用的術(shù)語"特異性結(jié)合"指抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原以至多約lxl(T6M、 1x1(T7M、1x1(T8M、1x1(T9M、lxlCT、、lxKTnM、1x1(T12M或更少的解離常數(shù)（Kd)結(jié)合的能力， 和/或與抗原以與其對(duì)非特異性抗原結(jié)合的親和力相比至少兩倍的親和力結(jié)合的能力。
[0065]本文所用術(shù)語"抗體"指對(duì)感興趣的抗原（例如，腫瘤相關(guān)抗原）具有顯著的已知 特異性免疫反應(yīng)活性的這些裝配體（例如，完整的抗體分子、抗體片段或其變體）?？贵w和 免疫球蛋白包含輕和重鏈，它們之間具有或不具有鏈間共價(jià)連接基。對(duì)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中基 本的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的了解相對(duì)充分。
[0066] 下文將進(jìn)一步詳述，遺傳學(xué)術(shù)語"抗體"包括可在生化上區(qū)分的五種不同抗體類 型。所有的五種抗體類型顯然都在本公開的保護(hù)范圍內(nèi)，接下來的討論將主要針對(duì)IgG類 免疫球蛋白分子。對(duì)于IgG，免疫球蛋白包括分子量大約為23, 000道爾頓的兩條相同輕鏈 以及分子量為53, 000-70, 000的兩條相同重鏈。四條鏈通過二硫鍵以"Y"構(gòu)型結(jié)合，其中 所述輕鏈以"Y"的開口處為起點(diǎn)托架起重鏈并延續(xù)通過可變區(qū)。
[0067]免疫球蛋白的輕鏈以k或A進(jìn)行分類（k，A)。每類重鏈可與k或A輕鏈結(jié) 合?？偟膩碚f，輕和重鏈彼此共價(jià)連接，且當(dāng)免疫球蛋白通過雜交瘤、B細(xì)胞或基因工程化 的宿主細(xì)胞生成時(shí)兩條重鏈的"尾"部通過共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)連接基彼此連接。在重鏈 中，氨基酸序列從位于Y構(gòu)型的叉狀末端的N末端延續(xù)至位于每條鏈底部的C末端。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員將理解，重鏈分為Y、U、a、S或e，其中還有一些亞類（例如，y1-y4)。 這種鏈的性質(zhì)決定了抗體的"種類"分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白同種型 亞類（例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等）已被充分表征且已知可賦予功能上的特性。 每個(gè)這些類型和同種型的修飾版本可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員鑒于本公開輕易辨別，并且因此 也在本公開的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0068] 輕和重鏈都被分為具有結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)。術(shù)語"區(qū)"指免疫球蛋白或抗體 鏈的一部分或一份且包括恒定區(qū)或可變區(qū)，以及更多所述區(qū)的離散部分或份。舉例來說，輕 鏈可變區(qū)包括如本文定義的分散在"框架區(qū)"或"FR"中的"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"⑶R"。
[0069]免疫球蛋白重鏈或輕鏈中的區(qū)可定義為"恒定"（C)區(qū)或"可變"（V)區(qū)，其依據(jù)在 "恒定區(qū)"的情況中是多種類別成員在所述區(qū)域內(nèi)相對(duì)缺乏序列變異，或在"可變區(qū)"的情況 中是多種類別成員在所述區(qū)域內(nèi)的顯著變異。術(shù)語"恒定區(qū)"和"可變區(qū)"也可用在功能上。 在這種情況下，應(yīng)該理解的是免疫球蛋白或抗體的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。反過來， 免疫球蛋白或抗體的恒定區(qū)賦予重要的效應(yīng)物功能如分泌、胎盤流動(dòng)性、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體 結(jié)合等等。多種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型已眾所周知。
[0070]免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)折疊成結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"指重鏈 或輕鏈的球形區(qū)，其包括通過例如折疊片層和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的肽環(huán)（例如，包括 3至4個(gè)肽環(huán)）。免疫球蛋白輕鏈上的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可與"輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域"、"CL區(qū)"或 "CL結(jié)構(gòu)域"互換指代。重鏈上的恒定區(qū)（例如，鉸鏈、CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域）可與"重鏈 恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域"、"CH"區(qū)結(jié)構(gòu)域或"CH結(jié)構(gòu)域"互換指代。輕鏈上的可變區(qū)可與"輕鏈可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域"、"VL區(qū)結(jié)構(gòu)域"或"VL結(jié)構(gòu)域"互換指代。重鏈上的可變結(jié)構(gòu)域可與"重鏈可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域"、"VH區(qū)結(jié)構(gòu)域"或"VH結(jié)構(gòu)域"互換指代。
[0071]按慣例可變恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號(hào)隨其距離免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或 氨基末端越來越遠(yuǎn)而增加。每條重和輕免疫球蛋白鏈的N末端為可變區(qū)且在C末端為恒定 區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重和輕鏈的羧基末端。相應(yīng)地，輕鏈免疫球蛋白的結(jié) 構(gòu)域以VL-CL方向排列，同時(shí)重鏈的結(jié)構(gòu)域以VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3方向排列。
[0072]重鏈恒定區(qū)中的氨基酸位點(diǎn)，包括在CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CL結(jié)構(gòu)域中的氨基酸 位點(diǎn)，可根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)（參見Kabatetal，in〃SequencesofProteins ofImmunologicalInterest"，U.S.Dept.HealthandHumanServices,第 5 版，1991)〇可 選地，抗體氨基酸位點(diǎn)可根據(jù)EU索引編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)（參見Kabatetal，同上）。
[0073] 本文所用術(shù)語"VH結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，且術(shù)語 "VL結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白輕鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域。
[0074] 本文所用術(shù)語"CH1結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白重鏈的第一（最靠氨基末端）恒定區(qū) 結(jié)構(gòu)域，其例如在Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)中延伸自約114-223位點(diǎn)（EU位點(diǎn)118-215)。CH1 結(jié)構(gòu)域與VH結(jié)構(gòu)域相鄰且在免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端，且并不構(gòu)成免疫 球蛋白重鏈的Fc區(qū)中的一部分。
[0075] 本文所用術(shù)語"鉸鏈區(qū)"包括重鏈分子中連接CH1結(jié)構(gòu)域與CH2結(jié)構(gòu)域的部分。鉸 鏈區(qū)包含約25個(gè)殘基且是柔性的，因此允許兩個(gè)N末端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立運(yùn)動(dòng)。鉸鏈區(qū)可進(jìn) 一步分為三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域：上、中和下鉸鏈結(jié)構(gòu)域（Roux等J.Immunol. 1998, 161 :4083)。
[0076] 本文所用術(shù)語"CH2結(jié)構(gòu)域"包括重鏈免疫球蛋白分子的如下部分，該部分例如在 Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)中延伸自約244-360位點(diǎn)（EU位點(diǎn)231-340)。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處 在于它與另一個(gè)結(jié)構(gòu)域并非緊密配對(duì)。相反，兩個(gè)N-連接的分支碳水化合物鏈插入在完整 的天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包括來自 IgGl分子的CH2結(jié)構(gòu)域（例如，人IgGl分子）。
[0077] 本文所用術(shù)語"CH3結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白分子的重鏈部分，其從CH2結(jié)構(gòu)域 的N末端延伸約110個(gè)殘基，例如，在Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)中從約361-476位點(diǎn)（EU位點(diǎn) 341-445)。CH3結(jié)構(gòu)域通常形成抗體的C末端部分。然而在一些免疫球蛋白中，額外的結(jié)構(gòu) 域可從CH3結(jié)構(gòu)域延伸以形成分子的C末端部分（例如，IgM的y鏈和IgE的e鏈的CH4 結(jié)構(gòu)域）。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包括來自IgGl分子（例如，人IgGl分子） 的CH3結(jié)構(gòu)域。
[0078] 本文所用術(shù)語"CL結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其例如延伸自約 107A-216Kabat位點(diǎn)。CL結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域相鄰。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽 包括來自k輕鏈的CL結(jié)構(gòu)域（例如，人k輕鏈）。
[0079] 本文所用術(shù)語"Fc區(qū)"定義為重鏈恒定區(qū)的部分，其開始于木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)直 接上游的鉸鏈區(qū)（即IgG中的殘基216,以重量可變區(qū)的第一殘基為114)并終止于抗體的 C末端。相應(yīng)地，完整的Fc區(qū)至少包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。
[0080] 本文所用術(shù)語"天然的Fc"指包含由抗體消化導(dǎo)致的或以其它方式產(chǎn)生的非抗原 結(jié)合片段序列的分子，無論是單體或多聚體形式，且可包含鉸鏈區(qū)。天然Fc的最初免疫球 蛋白來源優(yōu)選為人來源且所述免疫球蛋白可以是任何免疫球蛋白，雖然IgGl和IgG2為優(yōu) 選。天然Fc分子由單體多肽組成，通過共價(jià)（即，二硫鍵）和非共價(jià)結(jié)合成為二聚體或多 聚體形式。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)目范圍為1至4,取決于類型 (例如，IgG、IgA和IgE)或亞類（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgAl和IgGA2)。天然Fc的一個(gè) 實(shí)例是木瓜蛋白酶消化的IgG產(chǎn)生的二硫鍵鍵合的二聚體。本文使用的術(shù)語"天然Fc"可 通用于單體、二聚體和多聚體形式。
[0081] 本文所用術(shù)語"Fc變體"指從天然Fc修飾得到但仍包含用于挽救受體FcRn(新生 Fc受體）的結(jié)合位點(diǎn)的分子或序列。典型的Fc變體和它們與挽救受體（slavagereceptor) 的相互作用為本領(lǐng)域熟知。因此，術(shù)語"Fc變體"可包含從非人的天然Fc人源化的分子或 序列。此外，天然Fc包括可被去除的區(qū)，因?yàn)檫@些區(qū)提供本發(fā)明的抗體樣結(jié)合多肽不需要 的結(jié)構(gòu)特征或生物活性。因此，術(shù)語"Fc變體"包含缺少一個(gè)或多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基的 分子或序列，或其中的一個(gè)或多個(gè)Fc位點(diǎn)或殘基已被修飾的分子或序列，所述Fc位點(diǎn)或殘 基影響或參與：（1)二硫鍵形成，（2)與選擇的宿主細(xì)胞的不相容性，（3)當(dāng)在選擇的宿主細(xì) 胞中表達(dá)時(shí)的N末端異質(zhì)性，（4)糖基化，（5)與補(bǔ)體相互作用，（6)與Fc受體而非挽救受 體結(jié)合，或（7)抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC)。
[0082] 本文所用術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"涵蓋天然的Fc和Fc變體以及上文定義的序列。如同 Fc變體和天然Fc分子，術(shù)語"Fc結(jié)構(gòu)域"包括單體或多聚體形式的分子，無論是從完整抗 體消化得到還是由其它方式產(chǎn)生。
[0083] 上文表明，抗體的可變區(qū)使其選擇性地識(shí)別和特異性地結(jié)合在抗原上的表位。也 就是說，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域聯(lián)合形成限定三維的抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)（Fv)。 該四分抗體結(jié)構(gòu)形成在Y的每個(gè)臂的末端出存在的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，抗原結(jié)合位 點(diǎn)通過在每個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)限定。本文所用術(shù)語"抗原結(jié) 合位點(diǎn)"包括特異性地結(jié)合抗原（與其發(fā)生免疫反應(yīng)）的位點(diǎn)（例如，細(xì)胞表面或可溶抗 體）。抗原結(jié)合位點(diǎn)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)且由這些可變區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)決 定抗體的特異性。抗原結(jié)合位點(diǎn)通過一個(gè)抗體與另一個(gè)不同的可變區(qū)來形成。本公開的改 變的抗體包括至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包括至少兩個(gè)提供用于使結(jié)合多肽與選擇 的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域不需要來自相同的免疫球蛋白分子。在這 方面，可變區(qū)可以是或是來自任何類型的動(dòng)物，所述動(dòng)物可被誘導(dǎo)以針對(duì)期望的抗原產(chǎn)生 體液應(yīng)答并生成免疫球蛋白。因此，結(jié)合多肽的可變區(qū)可以舉例來說是哺乳動(dòng)物來源的，例 如，可以是人、鼠類、大鼠、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如食蟹猴、獼猴等）、羽扇豆或駝?lì)?(camelid)(例如，來自駱駝、美洲駝及相關(guān)物種）。
[0085] 在自然存在的抗體中，每種單體抗體上存在的六個(gè)CDR是短的、不連續(xù)的氨基酸 序列，隨著抗體在含水環(huán)境中呈現(xiàn)出三維構(gòu)象，CDR特異性地定位來形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。重 和輕可變結(jié)構(gòu)域的剩余部分展示較少的氨基酸序列分子內(nèi)變化性并稱為框架區(qū)?？蚣?