區(qū)主 要采取0折疊構(gòu)型而CDR形成環(huán)，其連接并且在某些情況下形成所述0折疊結(jié)構(gòu)的一部 分。因此，這些構(gòu)架區(qū)作用以形成支架，通過鏈間非共價(jià)相互作用為六個(gè)CDR提供以正確方 向的定位。通過定位的CDR形成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域界定了與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ) 的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與免疫反應(yīng)性抗原表位之間的非共價(jià)結(jié)合。
[0086] 本發(fā)明典型的結(jié)合多肽包括抗體變體。本文所用術(shù)語"抗體變體"包括改變的合 成和工程化形式的抗體，因此其并非天然存在的，例如，包含至少兩條重鏈的部分而非兩條 完全重鏈的抗體（如，結(jié)構(gòu)域刪除的抗體或小抗體（minibody));抗體的多重特異形式（例 如，雙特異性、三特異等），其經(jīng)改變以與兩種或多種不同的抗原或與單一抗原上的不同表 位結(jié)合）；與scFv分子結(jié)合的重鏈分子等等。此外，術(shù)語"抗體變體"包括多價(jià)形式的抗體 (例如，三價(jià)、四價(jià)等，與相同抗原的三個(gè)、四個(gè)或更多拷貝結(jié)合的抗體）。
[0087] 本文所用術(shù)語"價(jià)"指在多肽中潛在的靶結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)特異 性地結(jié)合一個(gè)靶分子或靶分子上的特異性位點(diǎn)。當(dāng)多肽包含多于一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，每個(gè) 靶結(jié)合位點(diǎn)可特異性地結(jié)合相同或不同分子（例如，可結(jié)合不同配體或不同抗原，或相同 抗原上的不同表位）。題述結(jié)合多肽優(yōu)選地具有至少一個(gè)特異性針對(duì)人抗原分子的結(jié)合位 點(diǎn)。
[0088] 術(shù)語"特異性"指特異性地結(jié)合（例如，與其發(fā)生免疫反應(yīng)）給定靶抗原（例如， 人的靶抗原）的能力。結(jié)合多肽可以是單一特異性的并包含一個(gè)或多個(gè)與靶特異性結(jié)合的 結(jié)合位點(diǎn)，或者多肽可以是多重特異性的并包含兩個(gè)或更多個(gè)與相同或不同靶特異性結(jié)合 的結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽特異性地針對(duì)相同靶的兩個(gè)不同（例 如，不重疊的）部分。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽特異性地針對(duì)多于一個(gè)靶。包 含與表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的典型結(jié)合多肽（例如，抗體）為本領(lǐng) 域公知且來自這種抗體的一種或多種CDR可包括在本發(fā)明的抗體中。
[0089] 術(shù)語"連接部分"包括能夠連接效應(yīng)物部分和本文公開的結(jié)合多肽的部分。可對(duì) 連接部分進(jìn)行選擇進(jìn)而使其是可裂解（例如，可酶促裂解或pH敏感）或不可裂解的。典型 的連接部分在本文的表2中闡述。
[0090] 本文所用術(shù)語"效應(yīng)物部分"包括具有生物或其它功能活性的診斷和治療劑（例 如，蛋白、核酸、脂質(zhì)、藥物部分及其片段）。舉例來說，包含與結(jié)合多肽偶聯(lián)的效應(yīng)物部分 的修飾結(jié)合多肽與非偶聯(lián)的抗體相比具有至少一種額外的功能或特性。舉例來說，細(xì)胞毒 性藥物（例如，效應(yīng)物部分）與結(jié)合多肽的偶聯(lián)導(dǎo)致具有藥物細(xì)胞毒性作為第二功能的結(jié) 合多肽（即，除抗原結(jié)合外）的形成。在另一個(gè)實(shí)例中，第二結(jié)合多肽與結(jié)合多肽的偶聯(lián)可 賦予額外的結(jié)合特性。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)效應(yīng)物部分是基因編碼的治療或診斷蛋白或 核酸時(shí)，效應(yīng)物部分可由本領(lǐng)域熟知的肽合成或重組DNA方法合成或表達(dá)。另一方面，當(dāng)效 應(yīng)物是非基因編碼的肽或藥物部分時(shí)，效應(yīng)物部分可以人工合成或從天然來源純化。本文 所用術(shù)語"藥物部分"包括抗炎、抗癌、抗感染（例如，抗真菌、抗細(xì)菌、抗寄生物、抗病毒等） 和麻醉治療劑。在另一實(shí)施方案中，所述藥物部分是抗癌或細(xì)胞毒性劑。相容的藥物部分 還可包括前體藥物。典型的效應(yīng)物部分在本文的表1中闡述。
[0091] 本文所用術(shù)語"前體藥物"指與母體藥物相比不那么具有活性、反應(yīng)性或易于發(fā) 生副作用的且能夠被酶激活或以其他方式在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成為更有活性的形式的藥物活性劑 的前體或衍生形式。與本公開的組合物相容的前體藥物包括但不限于，含磷酸鹽的前體藥 物、含氨基酸的前體藥物、含硫代磷酸的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含肽前體藥物、含 0 -內(nèi)酰胺的前體藥物、含任選地取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選地取代的苯基 乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶及其它可轉(zhuǎn)化成更有活性的、無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟尿 嘧啶前體藥物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)預(yù)期的藥物部分或其前體藥物進(jìn)行化學(xué)修飾，進(jìn)而 使該化合物的反應(yīng)更便于制備本公開的修飾的結(jié)合多肽。所述藥物部分還包括本文所述的 藥物部分的衍生物、藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺和醚。衍生物包括對(duì)本文鑒定的藥物的修 飾，其可改進(jìn)或不顯著降低特定藥物的預(yù)期治療活性。
[0092] 本文所用術(shù)語"抗癌劑"包括不利于贅生物或腫瘤細(xì)胞生長和/或增殖的作 用劑，且可作用以降低、抑制或破壞惡性腫瘤。這些作用劑的實(shí)例包括但不限于，細(xì)胞 抑制劑、烷化劑、抗生素、細(xì)胞毒性核苷、微管蛋白結(jié)合劑、激素、激素拮抗劑、細(xì)胞毒性 劑等等。細(xì)胞毒性劑包括托馬霉素衍生物（tomaymycinderivatives)、美登素衍生物 (maytansinederivatives)、Cryptophycine衍生物、蒽環(huán)類衍生物、二膦酸衍生物、細(xì)霉 素衍生物（leptomycinderivatives)、鏈黑菌素衍生物（streptonigrinderivatives)、auristatine衍生物和duocarmycin衍生物。作用于阻止或減慢免疫反應(yīng)性細(xì)胞或惡性腫 瘤細(xì)胞生長的任何作用劑都在本公開的范圍內(nèi)。
[0093] 本文所用術(shù)語"抗原"或"靶抗原"指能夠由結(jié)合多肽的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的分子或分 子的部分。靶抗原可以具有一個(gè)或多個(gè)表位。
[0094]II?結(jié)合多肽
[0095] -方面，本公開提供結(jié)合多肽（例如，抗體、抗體片段、抗體變體和融合蛋白），其 包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域包括：根據(jù)EU編號(hào)在氨基酸位點(diǎn)298的天冬酰胺殘基； 和根據(jù)EU編號(hào)在氨基酸位點(diǎn)300的絲氨酸或蘇氨酸殘基。
[0096] 來自任何免疫球蛋白（例如，IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)類型和物種的Fc結(jié)構(gòu)域 可用于本文公開的結(jié)合多肽。也可采用包含來自不同物種或Ig類型的Fc結(jié)構(gòu)域的部分的 嵌合Fc結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)構(gòu)域是人IgGlFc結(jié)構(gòu)域。在人IgGlFc 結(jié)構(gòu)域的情況中，在野生型氨基酸Kabat298位點(diǎn)成為天冬酰胺和在Kabat300位點(diǎn)成為 絲氨酸或蘇氨酸的突變導(dǎo)致N-連接糖基化共有位點(diǎn)的形成（S卩，N-X-T/S序列子，其中X是 除脯氨酸外的任何氨基酸）。然而，在其它物種和/或Ig類型或同種型的Fc結(jié)構(gòu)域的情況 中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解如果存在脯氨酸，那么有必要將Fc結(jié)構(gòu)域的Kabat299位點(diǎn) 突變以重新生成N-X-T/S序列子。
[0097] 本文公開的結(jié)合多肽涵蓋任何包含在根據(jù)Kabat編號(hào)的298位點(diǎn)具有N-連接的 糖基化位點(diǎn)的Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽是抗體，或其片段或衍 生物。來自任何來源或品種的任何抗體可被用于本文公開的結(jié)合多肽。適當(dāng)?shù)目贵w包括但 不限于，人抗體、人源化的抗體或嵌合抗體。
[0098] 在一些實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽可包含抗體的抗原結(jié)合片段。術(shù)語"抗原 結(jié)合片段"指結(jié)合抗原或針對(duì)抗原結(jié)合（即，特異性結(jié)合）與完整抗體（即，與其衍生來自 的完整抗體）競爭的免疫球蛋白或抗體的多肽片段?？乖Y(jié)合片段可由本領(lǐng)域熟知的重組 或生化方法產(chǎn)生。典型的抗原結(jié)合片段包括Fv、Fab、Fab'和（Fab'）2。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，本公開的抗原結(jié)合片段是改變的抗原結(jié)合片段，其包括至少一個(gè)工程化的糖基化位點(diǎn)。 在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，本公開的改變的抗原結(jié)合片段包含如上文所述的改變的VH結(jié) 構(gòu)域。在另一個(gè)典型的實(shí)施方案中，本公開的改變的抗原結(jié)合片段包含如上文所述的改變 的CH1結(jié)構(gòu)域。
[0099] 在典型的實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽包含單鏈可變區(qū)序列（ScFv)。單鏈可變區(qū)序 列包含具有一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)多肽，例如，通過柔性柔性接頭與VH結(jié)構(gòu)域連 接的VL結(jié)構(gòu)域。ScFv分子可以VH-接頭-VL的方向或VL-接頭-VH的方向構(gòu)建。連接構(gòu) 成抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL和VH結(jié)構(gòu)域的柔性鉸鏈優(yōu)選地包含約10至約50個(gè)氨基酸殘基。連 接肽為本領(lǐng)域已知。本發(fā)明的結(jié)合多肽可包含至少一個(gè)scFv和/或至少一個(gè)恒定區(qū)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽可包括至少一個(gè)與抗體或包含CH1結(jié)構(gòu)域（例如，包含 在Kabat114位點(diǎn)的天冬酰胺殘基的CH1結(jié)構(gòu)域）和/或CH2結(jié)構(gòu)域的片段（例如，包含 在EU298位點(diǎn)的天冬酰胺殘基和在EU300位點(diǎn)的絲氨酸或蘇氨酸殘基的CH2結(jié)構(gòu)域）連 接或融合的scFv。
[0100] 在一些典型的實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽是通過編碼抗體的DNA序列與ScFv 分子（例如，改變的ScFv分子）融合產(chǎn)生的多價(jià)（例如，四價(jià)）抗體。舉例來說，在一個(gè)實(shí) 施方案中，對(duì)這些序列進(jìn)行組合，從而將ScFv分子（例如，改變的ScFv分子）在其N末端 或C末端與抗體的Fc片段經(jīng)由柔性接頭（例如，gly/ser接頭）連接。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，本公開的四價(jià)抗體可通過將ScFv分子與連接肽融合生成，其與CH1結(jié)構(gòu)域融合（例如， 在Kabat第114位點(diǎn)包含天冬酰胺殘基的CH1結(jié)構(gòu)域）以構(gòu)建ScFv-Fab四價(jià)分子。
[0101] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽是改變的小抗體。本公開的改變的小抗 體是由兩條多肽鏈組成的二聚分子，所述每條多肽鏈包含與CH3結(jié)構(gòu)域或其部分經(jīng)由連接 肽融合的ScFv分子（例如，包含如上文所述的改變的VH結(jié)構(gòu)域的改變的ScFv分子）。小抗 體可通過構(gòu)建ScFv組分以及使用本領(lǐng)域描述的方法（參見，例如美國專利5, 837, 821或TO 94/09817A1)連接肽-CH3組分生成。在另一實(shí)施方案中，可構(gòu)建四價(jià)小抗體。除兩個(gè)ScFV 分子使用柔性接頭連接外，四價(jià)小抗體可以與小抗體相同的方式構(gòu)建。連接的scFv-scFv 構(gòu)建體隨后與CH3結(jié)構(gòu)域連接。
[0102] 在另一實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包含雙特異性抗體。雙特異性抗體是二聚 體四價(jià)分子，每個(gè)分子具有與scFv分子相似的多肽，但通常具有連接兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的短 (少于10且優(yōu)選為1-5)氨基酸殘基接頭，從而使在相同多肽鏈上的VL和VH結(jié)構(gòu)域不能 相互作用。取而代之的是，一條多肽鏈上的VL和VH結(jié)構(gòu)域與在第二多肽鏈上的VH和VL 結(jié)構(gòu)域（分別）相互作用（參見，舉例來說，W0 02/02781)。本公開的雙特異性抗體包含與 CH3結(jié)構(gòu)域融合的scFv分子。
[0103] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含多重特異性或多價(jià)抗體，其包含一個(gè) 或多個(gè)在相同多肽鏈上的系列可變結(jié)構(gòu)域，例如，串聯(lián)可變結(jié)構(gòu)域（TVD)多肽。典型的TVD 多肽包括描述于美國專利No. 5, 989, 830中的"雙頭"或"雙Fv"構(gòu)型。在雙Fv構(gòu)型中，兩 種不同抗體的可變結(jié)構(gòu)域在兩條分離的鏈上（一條重鏈和一條輕鏈）以串聯(lián)的方向表達(dá)， 其中一條多肽鏈具有通過肽接頭分開的串聯(lián)的兩倍VH(VH1-接頭-VH2)，而另一條多肽鏈 由肽接頭串聯(lián)連接的互補(bǔ)的VL結(jié)構(gòu)域組成（VL2-接頭-VL1)。在交叉雙頭構(gòu)型中，兩種 不同抗體的可變結(jié)構(gòu)域在兩條分離的多肽鏈上（一條重鏈和一條輕鏈）以串聯(lián)方向表達(dá)， 其中一條多肽鏈具有串聯(lián)的兩個(gè)由肽接頭分開的VH(VH1-接頭-VH2)，而另一條多肽鏈由 在相反方向通過肽接頭串聯(lián)連接的互補(bǔ)VL結(jié)構(gòu)域組成（VL2-接頭-VL1)?；?雙-Fv" 形式的其它抗體變體包括雙-可變-結(jié)構(gòu)域IgG(DVD-IgG)雙特異性抗體（參見美國專利 No. 7, 612, 181)和TBTI形式（參見US2010/0226923A1)。向雙-Fv的各條鏈添加恒定結(jié) 構(gòu)域（CHl-Fc向重鏈添加而k或X恒定結(jié)構(gòu)域向輕鏈添加）導(dǎo)致功能性雙特異性抗體而 無需任何額外修飾（即，恒定結(jié)構(gòu)域的明顯添加以增強(qiáng)穩(wěn)定性）。
[0104] 在另一典型實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包括基于"雙頭"構(gòu)型的交叉雙可變結(jié)構(gòu) 域IgG(CODV-IgG)雙特異性抗體（參見US20120251541A1，其在本文通過提述以其全 文并入）。CODV-IgG抗體