兼性減毒細(xì)菌種類及其制備和使用方法
【專利說(shuō)明】兼性減毒細(xì)菌種類及其制備和使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)案的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年11月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/723, 234號(hào)的權(quán)益，其特 此以其整體包括所有表格、附圖和權(quán)利要求在內(nèi)并入。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 下面對(duì)發(fā)明背景的討論僅僅是為了幫助讀者理解本發(fā)明而提供而未被承認(rèn)用于 描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0005] 根據(jù)定義，病原生物能夠在受感染的宿主中引起疾病。為了臨床使用這類生物，常 常產(chǎn)生表現(xiàn)出毒力降低或消除，但是仍然保持刺激針對(duì)目標(biāo)病原體或異種抗原的所需免疫 反應(yīng)的足夠活力的減毒疫苗菌株。已經(jīng)證明減毒載體平臺(tái)在許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，包括傳染病?惡性疾病中，引起對(duì)編碼的異種抗原有特異性的保護(hù)性反應(yīng)。
[0006] 雖然大多數(shù)減毒疫苗載體為病毒性的，但是已經(jīng)開(kāi)發(fā)出細(xì)菌疫苗載體平臺(tái)供預(yù)防 和治療應(yīng)用。許多其它病原菌的減毒菌株目前可用并且生成重組菌株易于操縱提供了將細(xì) 菌用作許多外源蛋白，例如與傳染病和癌癥相關(guān)的抗原的有效遞送媒介物的方式。尤其， 已經(jīng)由李斯特菌（Listeria)、埃希氏菌（Escherichia)、沙門氏菌（Salmonella)、志賀菌 (Shigella)、乳酸桿菌（Lactobacillus)和耶爾森氏菌（Yersinia)種類開(kāi)發(fā)出了活減毒細(xì) 菌疫苗菌株。
[0007] 雖然這種疫苗菌株可能表現(xiàn)出毒力降低，但是其安全性，特別是在免疫力低下的 個(gè)體中，仍令人擔(dān)憂。進(jìn)一步降低細(xì)菌疫苗風(fēng)險(xiǎn)的策略的一個(gè)實(shí)例為所說(shuō)的殺死但具有代 謝活性（"KBMA"）的方法。通過(guò)DNA修復(fù)基因例如UVrA和UVrB的缺失，消除核苷酸切除 修復(fù)的能力，構(gòu)建KBM疫苗菌株。基因缺失致使細(xì)菌對(duì)通過(guò)補(bǔ)骨脂素和UVA聯(lián)合治療的光 化學(xué)滅活極其敏感。由于其不能修復(fù)所形成的補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的DNA交聯(lián)，所以KBM細(xì)菌菌 株無(wú)法復(fù)制并且因此在功能上無(wú)感染性。與活減毒菌株相比，這種特征提供了改善的安全 性。然而交聯(lián)數(shù)量非常有限保存了其代謝活性，包括抗原表達(dá)，并因此保存其免疫潛力。然 而，生產(chǎn)表現(xiàn)出一致性質(zhì)的KBM菌株可能很難，因?yàn)閷?duì)交聯(lián)數(shù)量的滴定取決于許多難以控 制的變量。
[0008] 在本領(lǐng)域中仍然需要提供具有有利安全性，用于治療或預(yù)防具有風(fēng)險(xiǎn)-效益，不 適于活減毒疫苗的疾病的減毒細(xì)菌疫苗菌株。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供了兼性減毒細(xì)菌種類及其制備和使用方法。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"兼 性減毒"指包含一組限定重組修飾的細(xì)菌，所述重組修飾當(dāng)所述細(xì)菌在其宿主生物外部時(shí)， 大體上對(duì)所述細(xì)菌通過(guò)增殖而生長(zhǎng)的能力無(wú)影響，但是當(dāng)將所述細(xì)菌引入其宿主生物，例 如接種受者的宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，導(dǎo)致所述細(xì)菌增殖所必需的一個(gè)或多個(gè)基因缺失。這些重組 修飾利用優(yōu)先誘導(dǎo)基因在哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列。
[0011] 如下文所述，所述細(xì)菌最優(yōu)選為細(xì)胞內(nèi)病原體，例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (Listeriamonocytogene)〇
[0012] 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種構(gòu)造細(xì)菌以使所述細(xì)菌基因組內(nèi)對(duì)所述 細(xì)菌的增殖必需的一個(gè)或多個(gè)基因缺失的方法，所述缺失優(yōu)先在將所述細(xì)菌引入宿主時(shí)發(fā) 生。所述方法包括：
[0013] (i)向所述細(xì)菌內(nèi)重組引入編碼與所述細(xì)菌異源的重組酶的核酸，其中編碼所述 重組酶的所述核酸與優(yōu)先誘導(dǎo)所述重組酶在哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連 接，和
[0014] (ii)在所述細(xì)菌基因組內(nèi)，在對(duì)所述細(xì)菌增殖必需的基因上游重組引入所述重組 酶的第一附著位點(diǎn)，并且在對(duì)所述細(xì)菌增殖必需的基因下游重組引入所述重組酶的第二附 著位點(diǎn)。
[0015] 所述重組酶當(dāng)在所述哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)特異性誘導(dǎo)和表達(dá)時(shí)，催化使兩側(cè)為所述第 一和第二附著位點(diǎn)，對(duì)所述細(xì)菌增殖必需的基因缺失的位點(diǎn)特異性重組事件。在該位點(diǎn)特 異性重組事件之后，所述細(xì)菌具有增殖缺陷。
[0016] 如本文所使用的短語(yǔ)"大體上對(duì)所述細(xì)菌通過(guò)增殖而生長(zhǎng)的能力無(wú)影響"指其中 菌落形成為其它方面相同，但是缺乏上述的限定重組修飾的細(xì)菌的至少75%的細(xì)菌。為方 便起見(jiàn)，本文將缺乏經(jīng)重組引入的重組酶序列和經(jīng)重組引入的第一和第二附著位點(diǎn)的這種 細(xì)菌稱為"野生型"細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，菌落形成為野生型細(xì)菌的菌落形成的至少 80%，更優(yōu)選為野生型細(xì)菌的至少90%，并且最優(yōu)選為野生型細(xì)菌的至少95 %。在體外菌 落形成試驗(yàn)中測(cè)定菌落形成，并且表示為菌落形成單位（CFU)。
[0017] 如本文關(guān)于一個(gè)基因（或多個(gè)基因）所使用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)增殖必需"指基因缺失時(shí)，產(chǎn) 生其中菌落形成減少至野生型的1%或更低，和/或其中細(xì)菌在生物所含宿主細(xì)胞中的生 長(zhǎng)（按CFU測(cè)量）相對(duì)于野生型降低至少1000倍的細(xì)菌。優(yōu)選地，菌落形成減少至野生型 的0.01%或更低。本文稱已經(jīng)缺失這樣一個(gè)基因（或多個(gè)基因）的細(xì)菌"具有增殖缺陷"。
[0018] 在本發(fā)明的上下文中，對(duì)增殖必需的一個(gè)基因（或多個(gè)基因）的缺失優(yōu)先在將細(xì) 菌引入宿主生物時(shí)發(fā)生。如本文所使用，如果細(xì)菌引入宿主生物使菌落形成為野生型細(xì)菌 的菌落形成的至少75%的細(xì)菌轉(zhuǎn)化為菌落形成減少至野生型的1%或更少的細(xì)菌，則缺失 事件"優(yōu)先在宿主中"發(fā)生。優(yōu)選地，菌落形成減少至野生型的0.01%或更低。
[0019] 術(shù)語(yǔ)"優(yōu)先誘導(dǎo)所述重組酶在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列"指細(xì)菌引入宿主生物 后，誘導(dǎo)基因在其控制下表達(dá)至少10倍的調(diào)控序列。僅舉例而言，基因在李斯特菌的actA 啟動(dòng)子下的表達(dá)取決于稱為PrfA、用于轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)因子。相對(duì)于肉湯培養(yǎng)的李斯特菌， 當(dāng)李斯特菌存在于宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，大致誘導(dǎo)actA/PrfA調(diào)控下的基因表達(dá)200倍。因此，在 某些實(shí)施方案中，調(diào)控序列包括為PrfA依賴型的單核細(xì)胞增多性李斯特菌啟動(dòng)子。PrfA依 賴型啟動(dòng)子可選自inlA啟動(dòng)子、inlB啟動(dòng)子、inlC啟動(dòng)子、hpt啟動(dòng)子、hly啟動(dòng)子、plcA 啟動(dòng)子、mpl啟動(dòng)子和actA啟動(dòng)子。下文描述了對(duì)于其它細(xì)菌種類，誘導(dǎo)宿主生物中基因 表達(dá)的類似系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種優(yōu)先誘導(dǎo)的表達(dá)在將細(xì)菌引入宿主生物后增 加至少50倍，更優(yōu)選至少100倍，更加優(yōu)選至少1000倍。
[0020] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"宿主生物"指目標(biāo)細(xì)菌在如本文所述對(duì)增殖必需的一個(gè)基 因（或多個(gè)基因）沒(méi)有缺失時(shí)能夠在其中增殖的生物。在某些實(shí)施方案中，宿主生物為哺乳 動(dòng)物種類，最優(yōu)選為人。同樣，在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌為細(xì)胞內(nèi)病原體，并且當(dāng)細(xì)菌在哺乳 動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，調(diào)控序列優(yōu)先誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)。優(yōu)選的細(xì)菌屬選自李斯特菌屬、奈瑟 球菌屬（Neisseria)、分支桿菌屬（Mycobacterium)、弗朗西斯菌屬（Francisella)、桿菌屬 (Bacillus)、沙門氏菌屬（Salmonella)、志賀菌屬（Shigella)、耶爾森氏菌屬（Yersinia)、 布魯氏菌屬（Brucella)、軍團(tuán)菌屬（Legionella)、立克次氏體屬（Rickettsia,)和衣原體 屬（Chlamydia)。該列表并非意在限制。更優(yōu)選地，細(xì)菌為兼性胞內(nèi)細(xì)菌，例如李斯特菌、沙 門氏菌、志賀菌、弗朗西斯菌、分支桿菌、軍團(tuán)菌、伯克霍爾德菌（Burkholderia)和布魯氏 菌（Brucella)。在下文所述的某些示例性實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為單核細(xì)胞增多性李斯特 菌，包括經(jīng)修飾的諸如單核細(xì)胞增多性李斯特菌AActA/AInlB(其中天然ActA和InlB基 因已經(jīng)缺失或因突變致使功能上缺失的單核球增多性李斯特菌）。
[0021] 正如上面所提到的，經(jīng)重組引入細(xì)菌內(nèi)的重組酶序列與所述細(xì)菌異源。如本文所 使用，該術(shù)語(yǔ)指并非細(xì)菌基因組的正常組成部分的重組酶。在各實(shí)施方案中，重組酶可選自 C31整合酶、R4整合酶、TP901整合酶、BTl整合酶、BxBl整合酶、PSA整合酶、Cre重組酶、 Flp重組酶、XerC重組酶、A整合酶、HK022整合酶、P22整合酶、HPl整合酶、L5整合酶、 yS重組酶、Tn3重組酶、gin重組酶、RV整合酶、SPBc整合酶、TGl整合酶、Cl整合酶、MRll 整合酶、
[0022] 370整合酶、K38整合酶、W0整合酶和BL3整合酶。適合的重組酶附著位點(diǎn)可包 括重組引入的attB和attP位點(diǎn)。
[0023] 在某些實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)菌增殖必需的基因包括涉及DNA復(fù)制的至少一個(gè)基因。 這種基因可選自ori、dnaA、dnaN、gyrA、gyrB、polC、dnaE、ftsK、ftsZ、ligA、dnaG、parC、 parE、holB、dnaX、SMC和ftsY。
[0024] 如下文所述，對(duì)細(xì)菌增殖必需的多個(gè)基因常常集合在一起為單個(gè)操縱子。在這 種情況下，可能在操縱子的一部分上游優(yōu)先重組引入第一附著位點(diǎn)，并且在操縱子的一部 分下游重組引入第二附著位點(diǎn)，以致位點(diǎn)特異性重組事件使多個(gè)此類基因在單個(gè)事件中缺 失。優(yōu)選地，第一附著位點(diǎn)在操縱子上游，而第二附著位點(diǎn)在操縱子下游。第一和第二附著 位點(diǎn)可位于長(zhǎng)度為約20kb或更小，長(zhǎng)度為約IOkb或更小及長(zhǎng)度為約6kb的核酸序列的側(cè) 面。該上下文中的術(shù)語(yǔ)"約"指給定長(zhǎng)度的+/-10%。
[0025] 在某些實(shí)施方案中，將細(xì)菌用作用于表達(dá)與所述細(xì)菌異源的一個(gè)或多個(gè)基因的表 達(dá)平臺(tái)，例如為了對(duì)由這些基因表達(dá)的異源蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在這些實(shí)施方案中，細(xì)菌在 細(xì)菌基因組中可包含編碼異源多肽的外源核酸序列，其中所述外源核酸序列與當(dāng)細(xì)菌在哺 乳動(dòng)物宿主內(nèi)時(shí)，優(yōu)先誘導(dǎo)異源多肽表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接。
[0026] 在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種使細(xì)菌基因組內(nèi)對(duì)細(xì)菌增殖必需的一個(gè)或多個(gè)基因 缺失的方法。這些方法包括在其中由所述細(xì)菌表達(dá)重組酶的條件下，將本文所述的兼性減 毒細(xì)菌引入宿主生物，并且其中表達(dá)的重組酶通過(guò)所述位點(diǎn)特異性重組事件使對(duì)所述細(xì)菌 的增殖必需的所述一個(gè)或多個(gè)基因缺失。
[0027] 再一方面，本發(fā)明涉及一種兼性減毒細(xì)菌或其種群，例如