通常出現(xiàn)在第二細(xì)胞上。第二細(xì)胞可具有與第一細(xì)胞相同的身 份（相同名稱），或其可具有不同身份（不同名稱）。配體或受體可完全在細(xì)胞內(nèi)，即，其可 留在細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞核或一些其它胞內(nèi)隔室中。配體或受體可改變其位置，例如從胞內(nèi)隔室 改到質(zhì)膜的外面。配體和受體的復(fù)合物稱為"配體受體復(fù)合物"。配體和受體涉及信號通路 時，配體出現(xiàn)在信號通路的上游位置而受體出現(xiàn)在信號通路的下游位置。
[0079] "核酸"指呈單鏈、雙鏈形式或多鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合 物。核酸的非限制性實例例如cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。特定核酸序列也可隱含 地涵蓋"等位基因變體"和"剪接變體"。
[0080] "可操作地連接"在啟動子和編碼mRNA的核酸的上下文中意指啟動子可用于引發(fā) 該核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0081] 術(shù)語"序列同一性百分比"和"序列同一性％ "指通過比較或比對兩個或更多個 氨基酸或核酸序列發(fā)現(xiàn)的序列相似性百分比?？赏ㄟ^直接比較兩個分子之間的序列信息， 通過比對序列，為兩個比對序列之間的精確匹配數(shù)量計數(shù)，除以較短序列的長度，并將結(jié) 果乘以100,測定同一 ,性百分比。用于計算同一,性百分比的算法為Smith-Waterman同源 搜索算法（見，例如Kann和Goldstein(2002)Proteins48:367-376;Arslan等，（2001) Bioinformatics17:327-337)。
[0082] 當(dāng)提到多肽時，所謂"純化"和"分離"意指多肽在于自然界中與之締合的其它生物 大分子實質(zhì)性缺乏時存在。如本文所使用的術(shù)語"純化"意指鑒定的多肽按重量計常常占 存在的多肽的至少50 %，更常占至少60 %，通常占至少70 %，更通常占至少75 %，最通常占 至少80 %，一般占至少85 %，更一般占至少90 %，最一般地占至少95 %，并且常規(guī)地占至少 98%或更高。水、緩沖液、鹽、去垢劑、還原劑、蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑（包括添加的蛋白質(zhì)例 如白蛋白）和賦形劑及分子量小于1000的分子的重量通常不用于多肽純度的測定。見，例 如，頒發(fā)給Covacci等的美國專利第6, 090, 611號中的純度討論。
[0083] "肽"指短氨基酸序列，其中氨基酸通過肽鍵相互連接。肽可游離存在或與另一部 分結(jié)合，例如大分子、脂質(zhì)、寡糖或多糖和/或多肽。當(dāng)肽并入多肽鏈時，術(shù)語"肽"可能仍 用于特指短氨基酸序列。"肽"可通過肽鍵或一些其它類型的鍵合與另一部分連接。肽長度 為至少兩個氨基酸并且長度通常小于約25個氨基酸，其中最大長度為自定義或上下文的 函數(shù)。術(shù)語"肽"和"寡肽"可交換使用。
[0084]"蛋白質(zhì)"通常指組成多肽鏈的氨基酸序列。蛋白質(zhì)也可能指多肽的三維結(jié)構(gòu)。 "變性蛋白質(zhì)"指具有一些殘留三維結(jié)構(gòu)的局部變性多肽，或可選地，指基本上隨機(jī)的三 維結(jié)構(gòu)，即完全變性。本發(fā)明涵蓋多肽變體的試劑和使用多肽變體的方法，例如包括糖基 化、磷酸化、硫酸化、二硫鍵形成、脫酰胺作用、異構(gòu)化、信號或前導(dǎo)序列加工中的裂解點(diǎn)、共 價和非共價結(jié)合的輔因子、氧化變體等。描述了二硫鍵連接的蛋白質(zhì)的形成（見，例如， Woycechowsky和Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol. 4:533-539;Creighton等，（1995)TrendsBiotechnol.13:18-23)〇
[0085] "重組"當(dāng)關(guān)于（例如）核酸、細(xì)胞、動物、病毒、質(zhì)粒、載體等使用時，表示通過引 入外源、非天然核酸，改變天然核酸或通過由重組核酸、細(xì)胞、病毒、質(zhì)?；蜉d體完全或部分 衍生進(jìn)行的修飾。重組蛋白指（例如）源自重組核酸、病毒、質(zhì)粒、載體等的蛋白質(zhì)。"重組 菌"涵蓋其中基因組通過重組方法，例如通過突變、缺失、插入和/或重排的方式工程化的細(xì) 菌。"重組細(xì)菌"還涵蓋經(jīng)修飾為包括重組基因組外核酸，例如質(zhì)?；虻诙l染色體的細(xì)菌， 或現(xiàn)有基因組外核酸改變的細(xì)菌。
[0086] "樣本"指來自人、動物、安慰劑或研宄樣本的樣本，例如細(xì)胞、組織、器官、流體、氣 體、氣溶膠、漿料、膠體或凝固材料。"樣本"可在體內(nèi)試驗，例如無需從人或動物體內(nèi)取出， 或可在體外試驗。例如可在通過組織學(xué)方法加工后測試樣本。"樣本"還指（例如）包含流 體或組織樣本的細(xì)胞或與流體或組織樣本分離的細(xì)胞。"樣本"還可指從人或動物新鮮采集 的細(xì)胞、組織、器官或流體，或指經(jīng)加工或儲存的細(xì)胞、組織、器官或流體。
[0087] "可選標(biāo)記"涵蓋允許人們選出或淘汰含可選標(biāo)記的細(xì)胞的核酸?？蛇x標(biāo)記的實例 包括但不限于，例如：（1)編碼對其它有毒化合物提供抗性的產(chǎn)物（例如，抗生素），或編碼 對其它無害化合物（例如，蔗糖）的敏感性的核酸；(2)編碼另外缺乏受體細(xì)胞的產(chǎn)物（例 如，tRNA基因、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記）的核酸；（3)編碼抑制基因產(chǎn)物活性的產(chǎn)物的核酸；(4)編 碼可易于鑒定的產(chǎn)物（例如，表型標(biāo)記如半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白（GFP)、細(xì)胞表面蛋 白、表位標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽）的核酸；(5)可通過雜交技術(shù)，例如PCR或分子信標(biāo)鑒定的核酸。 [0088] 當(dāng)提到配體/受體、核酸/互補(bǔ)核酸、抗體/抗原或其它結(jié)合對（例如，細(xì)胞因子 與細(xì)胞因子受體）時，"特異性"或"選擇性"結(jié)合指示決定蛋白質(zhì)或其它生物制劑異源群體 中蛋白質(zhì)的存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定條件下，規(guī)定配體與特定受體結(jié)合而未以顯著量 與樣本中存在的其它蛋白質(zhì)結(jié)合。特異性結(jié)合也可意指，例如源自預(yù)期方法的抗體的抗原 結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合化合物、核酸配體、抗體或結(jié)合組合物與其靶標(biāo)結(jié)合，其中親和力常常比與 任何其它結(jié)合化合物的親和力高至少25%，更常高至少50%，最常高至少100% (2倍），一 般高至少10倍，更一般高至少20倍，并且最一般高至少100倍。
[0089] 在一典型實施方案中，例如通過斯卡查德分析（Scatchardanalysis)測定，抗體 的親和力將高于約l〇9L/mol(Munsen等，（1980)Analyt.Biochem. 107:220-239)。技術(shù)人員 認(rèn)為，一些結(jié)合化合物可與一種以上靶標(biāo)特異性結(jié)合，例如抗體與其抗原特異性結(jié)合，通過 抗體的寡糖與凝集素特異性結(jié)合，和/或通過抗體的Fc區(qū)與Fc受體特異性結(jié)合。
[0090] 細(xì)菌的"傳播"涵蓋"細(xì)胞與細(xì)胞傳播"，即例如通過泡囊介導(dǎo)，細(xì)菌從第一宿主細(xì) 胞傳遞到第二宿主細(xì)胞。與傳播有關(guān)的功能包括但不限于，例如肌動蛋白尾巴的形成、偽足 樣延伸的形成和雙層膜液泡的形成。
[0091] 如本文所使用的術(shù)語"受試者"指人或非人生物。因此，本文所述的方法和組合物 可適用于人和獸類疾病。在某些實施方案中，受試者為"患者"，即接受對疾病或病狀的醫(yī)療 護(hù)理的活人。這包括無限定疾病，正在調(diào)查病理學(xué)體征的人。
[0092] 重組酶的"靶位點(diǎn)"是被重組酶識別、結(jié)合和/或作用的核酸序列或區(qū)域 (見，例如頒布給Graham等的美國專利第6, 379, 943號；Smith和Thorpe(2002)Mol. Microbiol. 44:299-307;Groth和Calos(2004)J.Mol.Biol. 335:667-678 ;Nunes-Duby等， (1998)NucleicAcidsRes. 26:391-406)。
[0093] 將"治療有效量"定義為試劑或藥物組合物足以誘導(dǎo)對編碼的異種抗原有特異性 的所需免疫反應(yīng)，顯示出患者利益，即，使受治病狀的癥狀減少、預(yù)防或改善的量。當(dāng)試劑或 藥物組合物包含診斷劑時，將"診斷有效量"定義為足以產(chǎn)生信號、圖像或其它診斷參數(shù)的 量。藥物制劑的有效量將根據(jù)諸如個體敏感程度、個體的年齡、性別和體重及個體的特異反 應(yīng)等因素變化（見，例如頒布給Netti等的美國專利第5, 888, 530號）。
[0094] "治療（Treatment) "或"治療（treating) "（關(guān)于病狀或疾?。┦怯糜讷@得優(yōu)選 包括臨床結(jié)果在內(nèi)的有益或預(yù)期結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，關(guān)于疾病的有益或預(yù)期 結(jié)果包括但不限于以下一項或多項：改善與疾病相關(guān)的狀況，治愈疾病，減輕疾病的嚴(yán)重程 度，延緩疾病進(jìn)展，緩解與疾病相關(guān)的一種或多種癥狀，提高患病個體的生活質(zhì)量，和/或 延長生存期。同樣，為了本發(fā)明的目的，關(guān)于病狀的有益或預(yù)期結(jié)果包括但不限于以下一項 或多項：改善病狀，治愈病狀、減輕病狀的嚴(yán)重程度，延緩病狀進(jìn)展，緩解與病狀相關(guān)的一種 或多種癥狀，提高患病個體的生活質(zhì)量，和/或延長生存期。
[0095]"疫苗"涵蓋預(yù)防性疫苗。疫苗還涵蓋治療性疫苗，例如向包含與所述疫苗提 供的抗原或表位相關(guān)的病狀或疾病的哺乳動物施用的疫苗。已經(jīng)開發(fā)了許多細(xì)菌種 類，用作疫苗并且可用于本發(fā)明中，包括但不限于弗氏志賀菌（Shigellaflexneri)、 大腸桿菌（Escherichiacoli)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 (Yersiniaenterocolitica)、鼠傷寒'沙門氏菌（Salmonellatyphimurium)、傷寒'沙門氏 菌（Salmonellatyphi)或分支桿菌種類。該列表并非意在限制。見，例如，W004/006837、 W007/103225和W007/117371，其各自特此以引用的方式整體并入，包括所有表格、附圖和 權(quán)利要求。疫苗組合物中使用的細(xì)菌載體可為兼性、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌載體。細(xì)菌可用于將本文 所述的多肽遞送至宿主生物中的抗原呈遞細(xì)胞。如本文所述，單核細(xì)胞增多性李斯特菌為 本發(fā)明抗原的表達(dá)提供了優(yōu)選的疫苗平臺。
[0096] 2.將必需基因作為兼性缺失的目標(biāo)
[0097] 將工程化用于重組酶誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)死亡（RIID)的細(xì)菌編程為通過將重組引入的 重組酶基因的表達(dá)與細(xì)菌在宿主生物中時兼性表達(dá)的啟動子聯(lián)系起來"自殺"。下面舉例而 言，可使用PrfA依賴型啟動子使得重組酶的表達(dá)在李斯特菌內(nèi)呈兼性，PrfA依賴型啟動子 可選自inlA啟動子、inlB啟動子、inlC啟動子、hpt啟動子、hly啟動子、plcA啟動子、mpl 啟動子和actA啟動子。PrfA是在細(xì)胞內(nèi)激活，誘導(dǎo)連鎖基因在經(jīng)適當(dāng)工程化的疫苗菌株內(nèi) 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
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