漾濞大泡核桃轉錄因子基因JsWRKY1的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學以及基因工程相關研宄領域，特別是具有抗真菌活性的漾 濞大泡核桃轉錄因子基因的應用。
【背景技術】
[0002] 21世紀，人類面臨耕地減少、人口增加和人民生活水平不斷提高三個不可逆轉的 局面，提高農作物單產(chǎn)是解決這些問題的重要措施。然而植物病害嚴重影響農作物的產(chǎn)量 和質量，其中，真菌病害是最重要的一類植物病害，約占70% -80%，其發(fā)病率極高，且大規(guī) 模發(fā)生時導致農作物減產(chǎn)甚至死亡。傳統(tǒng)控制真菌病害的方法主要是選育抗性新品種、采 用合理的耕作制度和使用化學農藥，這些方法雖然取得了一定成效，但均不能從根本上解 決真菌病害問題。近年來，隨著分子生物學和生物技術的快速發(fā)展，利用基因工程方法培育 抗真菌病害的新品種取得了一定成效，有望從根本上解決真菌病害問題。
[0003] WRKY是植物體內重要的抗病相關轉錄因子，通過調控植物體內的病程相關蛋白 等抗病相關基因的表達來提高植物的抗病性，在植物抵御病原菌侵染的防衛(wèi)反應中扮演 著重要角色。最早被鑒定的植物WRKY基因是甘薯知iaias) 57仰（57y7:SWEET POTATO FACTOR 1)基因 （Ishiguro S, Nakamura Κ· 1994. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein, SPFlj that recognizes SP8 sequences in the upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato. Mol Gen Genet, 244: 563-571·)。WRKY 蛋白被分為三大類，第I類含有 2 個WRKY結構域以及C2H2型鋅指結構；第Π 類含有1個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，大 多WRKY轉錄因子都屬于這一類；第ΠΙ類含有1個WRKY結構域，但所含的鋅指結構為C2HC 型，此類 WRKY 轉錄因子的成員較少（Eulgem T，Rushton PJ，Robatzek S，Somssich IE. 2000. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Scij 5: 199-206.)。采用核磁共振技術研究AtWRKY4的結構發(fā)現(xiàn)其C端WRKY結構域由4股β 折疊構成，其中β折疊的末端含有一個由保守的半胱氨酸/組氨酸殘基形成的鋅結合口袋 結構。WRKYGQK序列存在于β-l鏈上，并可以通過扭曲進入DNA凹槽中，從而與靶基因中 的 W_box 相互作用（Pandey SP, Somssich IE. 2009. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. Plant Physiol, 150: 1648-1655·)。
[0004] 多種外源激發(fā)因子（細菌、真菌、病毒等病原物）和內源激發(fā)因子（水楊酸、乙 烯、過氧化氫等）均能誘導WRKY的基因表達。與此同時，WRKY也受多種非生物脅迫的誘 導，如鹽、熱、冷、紫外線等。Wang和Hao等研宄發(fā)現(xiàn)水稻（Crjza saiira) fts腸勺表 達量在茉莉酸處理后以及紫外線損傷后明顯增加 （Wang HH，Hao JJ，Chen XJ，Hao ZN， Wang Xj Lou YGj Peng YLj Gou ZJ. 2007. Overexpression of rice WRKY89 enhances ultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants. Plant Mol Biol, 65: 799-815.) 0在水稻中，白葉枯病原菌避?/7^5* 和SA可誘導胡勺 表達上調（Hwang SH, Yie SW, Hwang DJ. 2011. Heterologous expression of gene in Arabidopsis activates the expression of defense related genes and enhances resistance to pathogens. Plant Sci, 181: 316-323·)。Marchive 等在石開宄 葡萄汁厥《77基因時發(fā)現(xiàn)，其表達量受水楊酸、H2O2、或乙烯的誘導（Marchive C，Mzid R， Deluc L, Barrieu F, Pirrello J, Gauthier A, Corio-Costet MF, Regad F, Cailleteau B, Hamdi S et al. 2007. Isolation and characterization of a Vitis vinifera transcription factor, VvWRKYl, and its effect on responses to fungal pathogens in transgenic tobacco plants. J Exp Bot, 58: 1999-2010·)。
[0005] WRKY轉錄因子在植物抵御真菌病害過程中具有重要的調控作用。AtWRKY70在水 楊酸和茉莉酸介導的信號傳導途徑中具有中心控制作用，對受SA調控的基因具有激活作 用，而對受JA調控的基因具有抑制作用（Pieterse CMJ, Van Loon LC. 2004. NPRl: the spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr Opin Plant Biol, 7: 456-464.)。稻瘟病菌grisea)侵染、物理損傷以及外源生長素 的處理均可誘導水稻的表達，在水稻中過量表達增加了抗病相關基 浪 0sSci2 {subitilisin-chymotrypsin inhibitoi)熱 PBZl (a probenazole-inducible gene)的表達量并增強了轉基因植株對稻瘟病菌的抗性（Zhang J，Peng YL，Guo ZJ. 2008. Constitutive expression of pathogen-inducible 0sWRKY31 enhances disease resistance and affects root growth and auxin response in transgenic rice plants. Cell Res, 18: 508-521.)。擬南芥被死體營養(yǎng)型真菌 ciflerea和 fo-aMicico/a侵染以及水楊酸、茉莉酸處理后，腸的表達量增加。與 野生型相比，J ?腸?Τ??缺失突變體對于漢ciflerea和A feassicico/a的抗性降低， 而表達植株對這些病原菌的抗性則明顯增強（Zheng ZY，Qamar SA，Chen ZX, Mengiste T. 2006. Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens. Plant J, 48: 592-605. )〇
[0006] 本發(fā)明中轉錄因子基因/5#撒77來自漾擤大泡核桃Dode)。 漾濞大泡核桃是云南主要的本地核桃之一，具有果大、殼薄、仁厚、味香、含油率高等優(yōu)點， 對由膠孢炭疽菌引起的病害具有較強的抗性。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供漾濞大泡核桃轉錄因子基因/srMT/的新用途，即在提高煙 草對葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌抗性中的應用。
[0008] 本發(fā)明從漾濞大泡核桃中克隆獲得的具有抗真菌活性的全長基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，該基因全長為1012 bp，包含一個564 bp的開 放閱讀框、154 bp 的 5'非翻譯區(qū)（untranslated region, UTR)及 294 bp 的 3' UTR，編 碼如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質。
[0009] 本發(fā)明所述轉錄因子基因的編碼區(qū)是序列表SEQ ID NO :1中第155-719 位所示的核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明分離克隆漾濞大泡核桃的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，通過根 癌農桿菌介導將目的基因轉入受體植