物中過(guò)量表達(dá)，并通 過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物 抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)。發(fā)明人將這個(gè)基因命名為
[0011] WRKY是植物體內(nèi)研宄最多的轉(zhuǎn)錄因子之一，定位于細(xì)胞核。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與 靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中名為w-box的特定DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)或者抑制靶基因的表達(dá)。WRKY 能響應(yīng)各種生物和非生物脅迫，是植物防御系統(tǒng)中重要的組成部分。
[0012] 本發(fā)明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植 物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，對(duì)該 基因進(jìn)行分析，表明全長(zhǎng)cDNA為1012 bp，包含一個(gè)564 bp的開(kāi)放閱讀框、154 bp的Y UTR及294 bp的:V UTR，其中ORF編碼一個(gè)具有187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。核 酸同源性分析表明漾濞大泡核桃的第469~758位核苷酸序列與山葡萄（Kiii 1S Sffitfrez7lSi1S) Kar/?J7^5XJQ728450. 1)的第256~545位核苷酸序列具有86 %的同源性。 BLASTp分析結(jié)果顯示/^勝沿7所編碼WRKY蛋白與可可樹(shù)（TcWRKY75 (E0Y02841.1)和大豆（67_Fci/?e?az) GmWRKY53 (ΝΡ_001237357·1)的序列同源性較高，分 別為67%和60%。這表明其屬于漾濞大泡核桃中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。超表達(dá)序列表SEQ ID NO :1所示序列可以增強(qiáng)煙草對(duì)葡萄座腔菌t/oiAiofea)、串珠狀赤霉菌 {Gibberella moniliformi^)、狼觀裝備魯{Colletotrichum gloeosporioide^)認(rèn)及尖觀 鐮刀菌的抗性。
[0013] 上述基因可以應(yīng)用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下： (1)采用擴(kuò)增的特異引物，從接種膠孢炭疽菌后的漾濞大泡核桃葉中提 取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增出的全長(zhǎng)編碼區(qū)，然后將其連接到pMD-18T載體上，經(jīng)測(cè) 序獲得具有目的基因的克隆。
[0014] (2)用限制性內(nèi)切酶feMH / feoTPT酶切pMD18-T- /?Τ7載體和植物表達(dá)載體 PCAMBIA2300S，通過(guò)膠回收得到目的基因片段和載體大片段，再將所獲得基因片 段與PCAMBIA2300S載體片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體，之后將所構(gòu)建的重組載體通過(guò)根 癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)。
[0015] (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)PCR以及RT-PCR檢 測(cè)得到真正的轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于植物病原真菌的抗性，最后篩選出對(duì)真菌 抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016] 本發(fā)明為提高植物對(duì)真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過(guò)基因工程手段培 育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡(jiǎn)單，容易獲得高抗材 料。本發(fā)明中來(lái)自漾濞大泡核桃的/SMXT7基因能增強(qiáng)植物對(duì)幾種病原真菌的抗性，將該 基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性 植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)和不可取代的重要性。它不僅可以為大規(guī)模生產(chǎn)作物、花 丼等提供方便，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減少環(huán)境污染，因此本 發(fā)明具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是本發(fā)明中部分轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中 Marker :DL2000 DNA Marker (大連寶生物），由 2,000 bp、l，000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp六條DNA片段組成；正對(duì)照：質(zhì)粒pMD18-T-/JKD7為模板的PCR反應(yīng)；WT : 非轉(zhuǎn)基因煙草（野生型）總DNA為模板進(jìn)行的PCR ; 圖2是本發(fā)明中部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析結(jié)果， 其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物）；WT:非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為 模板的PCR產(chǎn)物；正對(duì)照：質(zhì)粒ρΜ018-Τ-/^ΤΜΤ7為模板的PCR產(chǎn)物； 圖3是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果圖；其中a、b、c、d、圖 示中的真菌分別是葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌；WT為野生型煙草 的總蛋白；CK為空白對(duì)照，即無(wú)蛋白對(duì)照（用于提取蛋白的緩沖液）。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi) 容，本實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常 規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0019] 實(shí)施例1 腸D7全長(zhǎng)cDNA克隆以及序列分析 用膠孢炭疽菌接種漾濞大泡核桃的嫩葉，用接種后4 h的葉提取總RNA，用液氮將處理 過(guò)的漾濞大泡核桃的葉研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采 用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過(guò)程為：取 5 yg 總RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 yL dNTP Mix (2.5 mM each)，用DEPC水將 反應(yīng)體積補(bǔ)齊至14. 5 yL;混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻5 min，然后依 次加入 4 yL 5 XFirst-stand buffer、?！?5 yL RNasin (200 U)、l yL M-MLV (200 U)， 混勻并簡(jiǎn)短離心，42°C溫浴I. 5 h，取出后70°C加熱10 min，終止反應(yīng)，cDNA第一鏈合成后 置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 以合成的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因所用上下游引物序列分別 為 5,-TGTAAAACCTATTCGGACATTCTTC-3f&?-ACCGAGGAGGGAGGCAGGT-3 i。采 用 Advantage? 2 PCR Enzyme (Clontech)擴(kuò)增出目的基因 。PCR 反應(yīng)條件：95°C I min; 94°C 30 s，62°C 30 s，72°C 45 s，32 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min。反應(yīng)體系（20yL)為 I yL cDNA、2 yL IOXAdvantage 2 PCR BufTer、l· 8 yL dNTP Mix (IOmM each)、。· 2 yL 正向 引物（10 μΜ)、0·2 yL 反向引物（10 μΜ)、0·2 yL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、 14. 6 μ L PCR-Grade water。PCR結(jié)束后，取8 μ L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 的特異性及大小。
[0021] 所得到PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，使用的試劑盒 為PMD18-T vector kit (大連寶生物），反應(yīng)體系和操作過(guò)程為：取1.5 yL PCR產(chǎn)物，依 次加入 I uL pMD18_T vector (50 ng/yL)和2.5 yL 2XLigation solution I，混勾后 置于16°C過(guò)夜反應(yīng)。通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。用含有 氨芐青霉素（ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。挑選若干個(gè)單菌落，搖菌 后用擴(kuò)增的特異引物檢測(cè)多克隆位點(diǎn)插入的克隆。將得到的陽(yáng)性克隆進(jìn) 行測(cè)序，最終獲得的/5,腸?Τ/全長(zhǎng) cDNA 為 1012 bp，通過(guò) NCBI ORF finder (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)564 bp的開(kāi)放讀碼框（見(jiàn)序列 表）。編碼一個(gè)含187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)JsWRKYl，其分子量約為21. 3 kDa，等電 點(diǎn)為9. 23。
[0022] 實(shí)施例2 :植物超表達(dá)載體構(gòu)建 采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（上海生工）提取插入的大腸桿 菌質(zhì)粒PMD18-T-/JKD7以及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300S質(zhì)粒，取1 μ L用于瓊脂糖凝膠 電泳以檢測(cè)所提取質(zhì)粒的完整性及濃度高低。用限制性內(nèi)切酶價(jià)oRI (TaKaRa)和及洲1 (TaKaRa)分別對(duì)質(zhì)粒 ρΜ018-Τ-/5ιΤ7δΟ7和 pCAMBIA2300S 進(jìn)行雙酶切（100 μ L 體系），反 應(yīng)體系和操作過(guò)程為：分別取20 yL PMD18-T-/S腸D7和pCAMBIA2300S質(zhì)粒、依次加入10 yL IOXH buffer、5 yL 價(jià)〇