7?/、5 yL 及麗7J、60 yL CldH2O，混勻后短時離心，置于 37°C 過夜反應(yīng)。將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑 盒（上海生工）對片段和pCAMBIA2300s載體大片段分別進(jìn)行膠回收，取1 μ L回 收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，其余回收產(chǎn)物置于_20°C保存 備用。
[0023] 利用 T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的/JKD7DNA 片段和 pCAMBIA2300S 載體 片段連接起來，反應(yīng)體系（20 μ L)和操作過程為：取10 μ L /^ffiDTDNA片段依次加入2 yL pCAMBIA2300S 載體 DNA、2 yL 10ΧΤ4 DNA Ligase BufferU yL Τ4 DNA Ligase、5 μ L ddH20,混勻后短時離心，然后16°C水浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入大腸桿菌DH5a中，用含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin，Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克 隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴(kuò)增的特異引物進(jìn)行PCR，挑選出 與PCAMBIA2300S成功連接的克隆，在得到的陽性菌株中加入甘油并置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 采用SanPr印柱式質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工）提取并純化上述大腸桿菌 DH5a中的pCAMBIA2300S-/JffiD7質(zhì)粒。隨后用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體 PCAMBIA2300S-/JKD7轉(zhuǎn)入所制備的根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。操作步驟為：取 0. 2 μ g ρ0ΑΜΒΙΑ23005-/^ΤΜΤ7質(zhì)粒加入含有200 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻 后冰浴5 min，隨后轉(zhuǎn)入液氮中冷凍I min，然后迅速置于37°C水浴5 min，再冰浴2 min，之 后加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基于28°C振蕩培養(yǎng)4 h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50 mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，再用擴(kuò)增的特異性引物 進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測PCAMBIA2300S-/JKD7是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油 后置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 實施例3 :農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選 本實驗的轉(zhuǎn)基因受體是煙草（Ai'coiiaaa iaAacw? L.)。將煙草種子用75%的酒精浸泡 30 s，無菌水洗滌后用0. 1%的HgCl2浸泡8 min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)5-8 d，發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱（25°C，16h/d光照），以后每月用 MS培養(yǎng)基繼代一次。
[0026] 從-80 °C冰箱中取出保存的含有ρ0ΑΜΒΙΑ23005-/^Μ?Τ7質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌 種，取20 μ L接種于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培 養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液至含有50 mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 48 h。隨后將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的 MGL液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)5-8 h以活化農(nóng)桿菌。
[0027] 取煙草無菌苗幼嫩葉切成約I cm2的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的MGL 液體培養(yǎng)基中，25°C浸染15 min。用無菌濾紙吸干葉盤表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基 上，22°C無光條件下共培養(yǎng)2天。煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0. 02 mg/L 6-BA+2. I mg/L NAA+30 g/L 鹿糖+6 g/L 瓊脂。
[0028] 將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時篩選轉(zhuǎn)基 因植株。煙草篩選培養(yǎng)基為MS+0. 5 mg/L 6-BA+O. I mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂 +50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱霉素 （cefotaxime sodium salt，Cef);篩選培養(yǎng)時將培養(yǎng)瓶 轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（25°C，16 h/d光照，8 h/d黑暗）。待煙草長出芽后用含有50 mg/ L Km和200 mg/L Cef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株 進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將煙草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用 生根較好的再生苗做進(jìn)一步的檢測。
[0029] 采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，取1 μ L所得基因組DNA進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用的 特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后，取8 UL產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉(zhuǎn)基因 植株。部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到49株陽 性轉(zhuǎn)基因植株，這些單株的編號為1~49。
[0030] 實施例4 :轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)基因植株抗真菌活性分析 分別取陽性轉(zhuǎn)基因植株以及非轉(zhuǎn)基因煙草（野生型）的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA第一鏈，并以此為模板用擴(kuò)增的特異引物進(jìn)行PCR，根據(jù)PCR結(jié)果分析各轉(zhuǎn)基 因植株中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。總RNA提取以及RT-PCR的方法與實施例1中相同。 PCR結(jié)束之后，取8 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結(jié)果如圖2所示，共檢測到 35個轉(zhuǎn)基因單株中在轉(zhuǎn)錄水平大量表達(dá)。
[0031] 將實驗室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基（200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂， 20 g/L葡萄糖）上，28°C暗培養(yǎng)，待菌落生長至直徑約為2~3 cm時添加蛋白，分析轉(zhuǎn)基因植 株體外抗真菌活性。供試真菌共有8種：膠孢炭疽菌腫 核盤菌葡萄座腔菌t/oiAiofea)、串珠狀赤 霉菌（?ofli/i/h/wis)、尖抱鏡刀菌、前腐鏡刀菌（/7. so7a/?i)、灰葡萄孢ciflerea)、輪枝鐮刀菌（Z7· reriiciBioiofes)。為了防止 其它雜菌污染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作。首先取I g轉(zhuǎn)基因煙 草單株（編號分別為8、17、18、43)及野生型葉片放入研缽中，加入1!^蛋白提取液（1皿 NaCl，0.1 M乙酸鈉，1% PVP，pH6. 0)，充分研磨。轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過 夜。4°C離心30 min (12, 000 g)，取上清于新的1.5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光 度儀測定總蛋白濃度；將轉(zhuǎn)基因和野生型植株的總蛋白濃度調(diào)整至0. 2 yg/yL，然后分別 取20 μ L滴于各真菌培養(yǎng)基的無菌濾紙上，在每個真菌的平板上除了添加不同轉(zhuǎn)基因煙草 植株的總蛋白，同時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照（蛋白提取液）；28°C培養(yǎng)幾 天后觀察各處理真菌生長的情況，并據(jù)此來評價轉(zhuǎn)基因煙草的體外抗真菌活性， 結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌以及 尖孢鐮刀菌的生長具有明顯的抑制作用。
【主權(quán)項】
1. 漾濞大泡核桃轉(zhuǎn)錄因子基因在提高煙草對葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠 孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌抗性中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的漾濞大泡核桃轉(zhuǎn)錄因子基因/srMT/的應(yīng)用，其特征在于提 高煙草的真菌抗性的具體操作如下： (1) 將漾濞大泡核桃轉(zhuǎn)錄因子基因與植物超表達(dá)載體PCAMBIA2300S連接，構(gòu) 建植物超表達(dá)載體； (2) 將上述構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中； (3) 用卡那霉素篩選再生的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選獲得陽性轉(zhuǎn) 基因植株，接種特定的植物病原真菌，分析轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對真菌生長的抑制活性，最后篩 選出對真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了漾濞大泡核桃轉(zhuǎn)錄因子基因JsWRKY1的應(yīng)用，本發(fā)明通過功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)研究證實JsWRKY1基因具有提高植物抗真菌病害的功能，將本發(fā)明抗真菌基因JsWRKY1構(gòu)建到植物表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草植株具有很強(qiáng)的體外抗真菌活性，JsWRKY1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草對葡萄座腔菌、串珠狀赤霉菌、膠孢炭疽菌以及尖孢鐮刀菌的生長具有明顯的抑制作用。
【IPC分類】C12N15-29, C12N15-84, A01H5-00
【公開號】CN104878041
【申請?zhí)枴緾N201510244681
【發(fā)明人】劉迪秋, 陳瑞, 王國東, 陳朝銀, 韓青, 葛鋒
【申請人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月14日