用于在植物中誘導無融合生殖的改進的方法
【專利說明】用于在植物中誘導無融合生殖的改進的方法
[0001] 描述
[0002] 本發(fā)明涉及用于在植物中誘導無融合生殖的方法、用于產(chǎn)生無融合生殖植物的方 法以及由此獲得的植物和植物種子。
[0003] 開花植物中的無融合生殖被定義為由胚珠的母本組織以無性方式形成種子，避免 了減數(shù)分裂和受精的過程，引起胚芽發(fā)育（Bicknell和K〇ltunow，2004)。因此，由以無融合 生殖方式形成的種子產(chǎn)生的植物與它們的祖代在基因上是相同的。一般來說，無融合生殖 的特征在于未減數(shù)的卵細胞在沒有減數(shù)分裂的情況下產(chǎn)生（無減數(shù)無配子生殖），所述未 減數(shù)的卵細胞進行孤雌發(fā)育成胚芽，所述胚芽與母本植物在基因上是相同的。有性的一些 方面可以被維持，這是因為受精（即假受精）在很大程度上對于具有平衡的母本與父本基 因組比率的功能性胚乳（即胚芽的滋養(yǎng)組織）的產(chǎn)生來說是必要的。
[0004] 在植物中經(jīng)由種子進行的自然發(fā)生的營養(yǎng)、非有性繁殖也被稱作無融合生殖，是 主要存在于一些多倍體非栽培物種中的植物的遺傳控制繁殖機制。各種類型的無融合生 殖，特別是配子體型和孢子體型可以被區(qū)分。在也被稱為不定胚生殖的孢子體型無融合生 殖中，體細胞胚并不是從配子體發(fā)育，而是直接從珠心、子房壁或珠被的細胞發(fā)育。來自周 圍細胞的體細胞胚侵襲有性子房，這些體細胞胚中的一個競爭過其它體細胞胚和有性胚 芽，并且利用所產(chǎn)生的胚乳。
[0005] 配子體型無融合生殖是無性種子形成的一種自然發(fā)生的類型，借此克隆母本基因 型的后代由未以減數(shù)分裂方式減數(shù)的胚囊，即雌配子體產(chǎn)生。大部分的配子體型無融合生 殖物種見于菊科（Asteraceae)、薔薇科（Rosaceae)以及禾本科（Poaceae)中，其中它們已 獨立地并且反復地出現(xiàn)。多倍性、兼性無融合生殖（一種個體內(nèi)存在有性和無融合生殖種 子產(chǎn)生這兩者）、以及無減數(shù)胚珠相對于有性胚珠的發(fā)育更快是這些分類群中的大多數(shù)之 間所共有的性狀。
[0006] 無融合生殖源自于有性繁殖，并且對于有性植物來說必須取得以下三個獨立的發(fā) 育步驟才能以無融合生殖方式產(chǎn)生種子：未減數(shù)的大孢子的形成，這意味著與母本植物的 體細胞具有相同的倍性的胚囊由未以減數(shù)分裂方式減數(shù)的大孢子（二倍性孢子形成、無減 數(shù)無配子生殖）或由珠心細胞（無孢子生殖）形成；在不存在受精的情況下隨后由未減數(shù) 的卵細胞發(fā)育胚芽（孤雌生殖）；以及雙核中央細胞受精以形成功能性胚乳（假受精）。術 語"無減數(shù)無配子生殖"涵蓋了無孢子生殖和二倍性孢子形成這兩者。以無減數(shù)方式產(chǎn)生 的胚芽因此經(jīng)由母系接受它的整個基因組。由于這些組分處在獨立的遺傳控制下，因此很 難在考慮隨機突變的情況下設想所有這三者如何可以在有性的祖代中一致地演化，這是因 為任何單個步驟的表達將降低它的有性載體的適應性。已被廣泛接受的是，無融合生殖種 子發(fā)育由有性發(fā)育途徑的失調(diào)所引起，所述失調(diào)將在多個基因座上同時表現(xiàn)。在野生的無 融合生殖分類群中，假設這種協(xié)調(diào)的失調(diào)受到由雜交和/或多倍性所引起的整體調(diào)節(jié)變化 的影響（Grossniklaus, 2001，從有性到無融合生殖：分子和遺傳學方法（Fromsexuality toapomixis:Molecularandgeneticapproaches)，《無融合生殖的繁榮：從機制到遺 傳工程化〉〉（Thefloweringofapomixis:FromMechanismstoGeneticEngineering) 中，168-211)。
[0007] 最近的報道在筷子芥屬（Boechera)的顯微解剖的胚珠中對無減數(shù)無配子生殖的 基因表達（意指未減數(shù)配子的形成）進行分析，并且能夠在發(fā)育的特定階段，即大孢子母細 胞（MMC)階段鑒定出相當大量的在有性胚珠與無減數(shù)胚珠之間差異表達的等位基因。進一 步的研宄集中于在有性胚珠和無減數(shù)胚珠中在一系列的發(fā)育階段期間基因表達譜的異時 性（Sharbel等人，2009,ThePlantJournal, 58, 870-882;Sharbel等人，2010,ThePlant Cell，22, 655-671)。然而，盡管現(xiàn)有技術預期地展示了通過特定的分子標記對無融合生殖 胚珠和有性胚珠進行表征，但它并未提供任何有關如何在所需的植物中以可靠的并且可預 見的方式，特別是借助于常規(guī)的基因轉(zhuǎn)移技術來誘導無融合生殖的提示。
[0008] 實際上，在鑒定控制無融合生殖的分子遺傳機制中的主要困難之一在于幾乎所有 的無融合生殖體的基因組均具有多倍性和雜合性這兩種性質(zhì)。盡管已付出了相當大的努 力，包括深入的功能性分子分析，來分析無融合生殖現(xiàn)象的根本分子體制，但迄今為止以單 獨地對任一種效應的影響進行控制仍然是一項挑戰(zhàn)，這兩者都可能具有不同的調(diào)節(jié)后果。
[0009] 針對可控制的更可再現(xiàn)的性狀對無融合生殖進行工程化將在植物改良和栽培品 種開發(fā)中提供許多優(yōu)勢。無融合生殖將提供純育、種子繁殖的雜種?？刂茻o融合生殖因此 將極大地有助于并且促進植物育種人員固定并且可靠地繁殖作物植物中的遺傳雜合性和 相關的雜種優(yōu)勢的能力。此外，無融合生殖可以縮短并且簡化常規(guī)的育種過程，以使得可以 避免自體受精和后代測試以產(chǎn)生理想的基因組合或使理想的基因組合穩(wěn)定。
[0010] 無融合生殖的受控使用因此必然將簡化商業(yè)雜種種子生產(chǎn)。具體來說，將消除對 物理隔離商業(yè)雜種生產(chǎn)場地的需要，可供使用的陸地均可以被用于使雜種種子生長而不是 在授粉媒介與雄性不育系之間隔開，并且最終將消除維持親本系種子儲備的需要。
[0011] 無融合生殖將提供具有獨特的基因組合的基因型作為栽培品種的用途，這是因為 無融合生殖基因型是純育的而與雜合性無關?；蚧蚧虻娜航M因此可以在超級基因型中 被固定。來自有性-無融合生殖雜交的每一種優(yōu)越的無融合生殖基因型均有可能成為栽培 品種。無融合生殖因此將允許植物育種人員針對諸如高度、種子和飼草質(zhì)量以及成熟之類 的特征開發(fā)出具有特定的穩(wěn)定性狀的栽培品種。
[0012] 因此，無融合生殖在農(nóng)業(yè)中的應用被認為是一種重要的使能技術，它將 極大地有助于作物植物中的遺傳雜合性和相關的雜種優(yōu)勢的固定和可靠的繁殖 (Spillane, 2004,NatBiotech22(6), 687-691)〇
[0013] 然而，所有這些依賴于經(jīng)由無融合生殖來生產(chǎn)種子的潛在益處目前均在很大程度 上由于將無融合生殖能力工程化到所關注的植物中的問題而尚未實現(xiàn)。
[0014]US2002/0069433A1公開了用于提高新一代植物的營養(yǎng)繁殖概率的方法，其中以 轉(zhuǎn)基因方式使編碼在由體細胞胚芽發(fā)生受體激酶觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)中起作用的蛋白質(zhì) 的基因表達。US2008/0155712A1公開了用于在植物，特別是玉米中鑒定，特別是通過基因 組定位來鑒定負責無融合生殖發(fā)育的序列的方法。W0 99/35258A1公開了來自狼尾草屬 (Pennisetum)的無孢子生殖特異性基因組區(qū)域的核酸標志物。US7,541，514B2公開了由 有性植物通過對特定的植物品系進行選擇、采集以及育種而產(chǎn)生無融合生殖植物的方法。
[0015] 所述公開內(nèi)容都沒有提供可以容易用于基因轉(zhuǎn)移方法中以可控制的并且低成本 的方式在植物中獲得無融合生殖的方法。
[0016] 本發(fā)明的根本技術問題因此在于提供克服上文所示的問題的方法，特別是提供例 如借助于重組基因技術，特別是借助于重組DNA轉(zhuǎn)移技術將無融合生殖引入到植物中的方 法，特別是提供在植物中，特別是以可控制的、可預見的、可靠的、容易的并且有成本效益的 方式誘導無融合生殖以及獲得無融合生殖植物的方法。
[0017] 本發(fā)明通過提供獨立權利要求的教導，特別是通過提供在植物中誘導無融合生殖 的方法、產(chǎn)生無融合生殖植物的方法以及由此獲得的植物來解決它的根本問題。
[0018] 因此，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無融合生殖植物的方法，所述方法包括下列步 驟：
[0019]a)提供植物細胞，
[0020] b)將所述植物細胞用含有至少一種外源性核苷酸序列元件的至少一種植物載體 轉(zhuǎn)化以獲得轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞包含所述至少一種外源性核苷酸序列元 件并且所述轉(zhuǎn)基因植物細胞包含編碼反式作用無融合生殖效應子的核苷酸序列、順式作用 調(diào)節(jié)元件以及在所述順式作用調(diào)節(jié)元件控制下的編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白 質(zhì)的核苷酸序列，其中所述反式作用無融合生殖效應子能夠與所述順式作用調(diào)節(jié)元件相互 作用并且其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件包含選自以下的至少一種調(diào)節(jié)核苷酸核心序列：
[0021] SEQIDNo. 66或67中的任一個的ATHB-5結合位點、SEQIDNo. 68至73中的任 一個的UM-1結合位點、SEQIDNo. 74或75中的任一個的S0RLIP1AT結合位點、SEQID No. 76或77中的任一個的S0RLIP2AT結合位點、以及SEQIDNo. 78或79中的任一個的 P0LASIG1結合位點，以及
[0022] c)使所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生成表現(xiàn)出無融合生殖的轉(zhuǎn)基因植物。
[0023] 因此，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無融合生殖植物的方法。這些方法包括一系 列工藝步驟a)、b)以及c)，在優(yōu)選的實施方案中由一系列工藝步驟a)、b)以及c)組成。 進行所述工藝步驟a)、b)以及c)還適合于在植物中誘導無融合生殖。因此，本發(fā)明還涉及 用于在植物中誘導無融合生殖的方法，所述方法特別是由上文所示的步驟a)、b)以及c)組 成，包括上文所示的步驟a)、b)以及c)。對于這樣的教導，本發(fā)明的下列技術考慮因素均 適用，并且對于本領域技術人員來說是明顯的。
[0024] 本發(fā)明的方法教導了提供植物細胞，特別是來自有性繁殖植物的植物細胞，以及 將所述植物細胞用含有至少一種外源性核苷酸序列元件的至少一種植物載體轉(zhuǎn)化以獲得 轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞意指除了步驟a)中所提供的植物細胞中內(nèi)源性地 存在的遺傳物質(zhì)之外，植物細胞還包含至少一種外源性核苷酸序列元件，所述至少一種外 源性核苷酸序列元件因此在步驟a)中所提供的所述植物細胞中并不天然存在或并不天然 存在于特定的基因組位置處。通過植物載體被轉(zhuǎn)移到植物細胞中的所述至少一種外源性核 苷酸序列元件是編碼反式作用無融合生殖效應子的核苷酸序列、順式作用調(diào)節(jié)元件，特別 是啟動子，最優(yōu)選地含有調(diào)節(jié)核苷酸核心序列的啟動子，或包含這兩者。在優(yōu)選的實施方案 中，所述外源性核苷酸序列元件包含與編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸 序列功能性地并且可操作地連接的順式作用調(diào)節(jié)元件。經(jīng)過所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物因 此接受被穩(wěn)定地整合到它的基因組中的所述至少一種外源性核苷酸序列元件。
[0025] 在工藝步驟b)中所獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞包含編碼反式作用無融合生殖效應子 的核苷酸序列、順式作用調(diào)節(jié)元件以及編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，其中所述編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列處在所述順式作用 調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制下，特別是在轉(zhuǎn)錄控制下，并且其中至少編碼反式作用無融合生殖效 應子的核苷酸序列或任選地與編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可 操作地連接的順式作用調(diào)節(jié)元件已在工藝步驟b)中被轉(zhuǎn)化到所述植物細胞中。因此，這兩 種上文所示的核苷酸序列中的至少一種是被引入到所要轉(zhuǎn)化的植物細胞中的外源性核苷 酸序列。
[0026] 反式作用無融合生殖效應子在特別優(yōu)選的實施方案中是反式作用轉(zhuǎn)錄因子，特別 是DNA結合轉(zhuǎn)錄因子。
[0027] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，用于轉(zhuǎn)化步驟（a)中所提供的植物細胞的植物載 體包含編碼所述反式作用無融合生殖效應子的核苷酸序列或包含所述順式作用調(diào)節(jié)元件 的核苷酸序列或這兩者作為外源性核苷酸序列元件。因此，本發(fā)明假定作為在步驟b)中通 過轉(zhuǎn)化植物細胞所獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞的特征的外源性核苷酸序列元件是編碼反式作 用無融合生殖效應子的核苷酸序列或包含順式作用調(diào)節(jié)元件，特別是本發(fā)明的所謂的"調(diào) 節(jié)核苷酸核心序列"的核苷酸序列，或這兩者。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，在所述植物 載體含有順式作用調(diào)節(jié)元件的情況下，它還包含與所述順式作用調(diào)節(jié)元件可操作地連接的 具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。因此，工藝步驟b)的當前所獲得的轉(zhuǎn) 基因植物細胞的特征在于存在轉(zhuǎn)基因核苷酸序列，所述轉(zhuǎn)基因核苷酸序列包含反式作用無 融合生殖效應子、轉(zhuǎn)基因順式作用調(diào)節(jié)元件，特別是本發(fā)明的調(diào)節(jié)核苷酸核心序列，或這兩 者，并且其中所述核苷酸序列并非內(nèi)源性地存在于步驟a)中所提供的植物細胞中或并非 存在于在轉(zhuǎn)化步驟之后所實現(xiàn)的所述特定的基因組位置處。
[0028] 本發(fā)明的教導是基于本申請的發(fā)明人的以下貢獻：在轉(zhuǎn)化的植物細胞中，特別是 以增加表達的方式，提供本發(fā)明的特定的反式作用無融合生殖效應子允許在植物細胞中誘 導無融合生殖表型。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，假定將所述植物細胞用至少一種植 物載體轉(zhuǎn)化，所述植物載體包含編碼反式作用無融合生殖效應子的核苷酸序列，所述核苷 酸序列優(yōu)選地處在調(diào)節(jié)序列，特別是強組成型或誘導型啟動子的控制之下，特別是允許表 達與野生型表達相比有所增加。因此，這種編碼反式作用無融合生殖效應子的核苷酸序列 在植物細胞中被轉(zhuǎn)化、整合并且表達之后將優(yōu)選地允許表達有所增強或改良以及產(chǎn)生反式 作用無融合生殖效應子，以允許，在優(yōu)選的實施方案中連同與編碼具有DEDDh核酸外切酶 活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作地連接的順式作用調(diào)節(jié)元件一起允許所需的無融合生 殖表型產(chǎn)生。優(yōu)選地與編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作地連 接的順式作用調(diào)節(jié)元件可以是內(nèi)源性存在的核苷酸序列或可以是外源性轉(zhuǎn)基因核苷酸序 列元件本身。
[0029] 在一個實施方案中，本發(fā)明的包含至少一種調(diào)節(jié)核苷酸核心序列的優(yōu)選地與DEDDh核酸外切酶可操作地連接的特定的順式作用調(diào)節(jié)元件的引入引起所述核酸外切酶在 通過本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物的胚珠中表達并且從而為本發(fā)明的植物提供了無融合生殖 表型。本發(fā)明因此教導了特定的反式作用無融合生殖效應子與特定的順式作用調(diào)節(jié)元件， 特別是本發(fā)明的調(diào)節(jié)核苷酸核心序列的特定的相互作用。
[0030] 本發(fā)明基本上是基于代表所謂的apollo基因的核酸分子或其必要的和特定的部 分，所述apollo基因意指"無融合生殖相關基因座(Apomixislinkedj^cus) "。所述基因， 特別是它的編碼序列對apollo蛋白質(zhì)進行編碼，所述apollo蛋白質(zhì)在植物胚珠中表達后 會引起無融合生殖種子產(chǎn)生。
[0031] 本發(fā)明有利地使用了呈分離和純化形式的多核苷酸，特別是編碼能夠在植物中誘 導無融合生殖的蛋白質(zhì)，即apollo蛋白質(zhì)，的多核苷酸，以及能夠充當所述編碼序列的調(diào) 節(jié)元件的多核苷酸。此外，本發(fā)明是基于以下教導：植物，特別是它們的基因組內(nèi)源性地包 含編碼所述能夠誘導無融合生殖的apollo蛋白質(zhì)的核苷酸序列，在下文中也被稱為"多核 苷酸"或"多核苷酸序列"以及它的調(diào)節(jié)元件，在下文中也被稱為"內(nèi)源性地存在編碼能夠在 植物中誘導無融合生殖的蛋白質(zhì)的多核苷酸"。因此，例如以SEQIDNo. 37、40、43、46、49或 52所指定的編碼序列和調(diào)節(jié)序列這兩者通常以各種等位基因狀態(tài)內(nèi)源性地存在于它們在 植物中，特別是十字花科（Brassicaceae)，優(yōu)選地筷子芥屬中的天然和原始的基因組環(huán)境 中，并且引起有性或無融合生殖表型在植物中的產(chǎn)生。然而，在天然存在的有性繁殖的植物 中，所述核苷酸序列（呈它們的有性等位基因狀態(tài)，在下文中也被稱作"有性等位基因"）， 如SEQIDNo. 46、49或52中的核苷酸序列在所述植物的胚珠中受到阻遏、抑制、或未被激 活、或失活（這意指不表達），從而阻止無融合生殖。相比之下，所述多核苷酸（呈它的無融 合生殖等位基因狀態(tài)，在下文中也被稱作"apo等位基因")，如SEQIDNo. 37、40或43中的 多核苷酸在無性繁殖的植物的胚珠中被誘導或去阻遏、或并未失活，這意指表達，所述植物 意指無融合生殖植物。
[0032] 具體來說，本發(fā)明是基于如下的教導：在有性繁殖的植物的植物胚珠中，內(nèi)源性存 在的編碼具有無融合生殖誘導能力的apollo蛋白質(zhì)的基因在所述組織中被抑制、阻遏、未 被激活、或失活，并且因此需要被