于有性植物和無(wú)融合生殖植物分別匯集處在多個(gè)發(fā)育 階段的花，繼而進(jìn)行cDNA標(biāo)準(zhǔn)化程序以抵消轉(zhuǎn)錄物水平來(lái)提高對(duì)所有可觀測(cè)到的mRNA種 類進(jìn)行測(cè)序的可能性。此外，使用3'-UTR(非翻譯區(qū)）錨定454程序以使得mRNA序列偏向 于它們的3'-UTR(所述區(qū)域表示相對(duì)高（但非隨機(jī)）的變異水平），以使得能夠鑒定等位基 因變異。
[0203] 使用CLC基因組學(xué)工作平臺(tái)，使用用于長(zhǎng)讀數(shù)高通量序列的標(biāo)準(zhǔn)組裝參數(shù)，在使 用內(nèi)部序列質(zhì)量得分對(duì)所有讀數(shù)進(jìn)行修整之后對(duì)454序列進(jìn)行組裝。在這樣做時(shí)，獲得 36289個(gè)重疊群序列（contigsequence)和154468個(gè)未組裝的單拷貝序列（singleton sequence)。向ImaGenes(有限公司，德國(guó)）提供這一數(shù)據(jù)以使用它們的預(yù)選策略（PSS)服 務(wù)進(jìn)行微陣列研發(fā)。
[0204]PSS服務(wù)如下運(yùn)作：對(duì)每個(gè)重疊群14個(gè)不同的寡核苷酸（每一個(gè)的長(zhǎng)度是60bp) 和每個(gè)單拷貝8個(gè)寡核苷酸（包括每一個(gè)寡核苷酸的"反義"序列在內(nèi)）進(jìn)行生物信息學(xué)設(shè) 計(jì)并且點(diǎn)樣到兩個(gè)1百萬(wàn)點(diǎn)測(cè)試陣列上。使用以下各項(xiàng)對(duì)這些測(cè)試陣列進(jìn)行探測(cè)：（1) "復(fù) 雜cRNA混合物"（通過(guò)匯集組織并且從它們采集所有RNA來(lái)獲得），以及（2)從有性個(gè)體和 無(wú)融合生殖個(gè)體匯集的葉片組織所提取的基因組DNA?；趤?lái)自cRNA和基因組DNA樣品的 單獨(dú)雜交結(jié)果，并且在所有質(zhì)量測(cè)試之后，設(shè)計(jì)出最終的2X105000點(diǎn)陣列。這個(gè)陣列應(yīng)當(dāng) 含有在筷子芥屬花發(fā)育期間表達(dá)的每一種基因的多個(gè)寡核苷酸（即技術(shù)重復(fù)樣品）。
[0205]l.d.ii)雜交
[0206] 制備cRNA并且使用Quick-Amp單色標(biāo)記試劑盒（加利福尼亞州的安捷倫科技公 司）標(biāo)記并且與Agilent定制的筷子芥屬陣列雜交（對(duì)于有性基因型和無(wú)融合生殖基因型 分別雜交8個(gè)和10個(gè)生物重復(fù)樣品）。
[0207] 1.d.iii)統(tǒng)計(jì)分析
[0208] 使用GeneSpringGX軟件（10版）進(jìn)行分析并且基于下列參數(shù)選擇在無(wú)融合生 殖植物與有性植物之間顯著差異性表達(dá)（P< 〇. 05)的候選探針：(a) 75百分位數(shù)平移標(biāo) 準(zhǔn)化（percentileshift75normalization)，中值作為基線，繁殖方式（無(wú)融合生殖或有 性）作為解釋（第一水平）、不成對(duì)T檢驗(yàn)作為統(tǒng)計(jì)分析以及BonferroniFWER多重檢驗(yàn) 校正。使用最高的顯著性水平閾值，使得對(duì)微陣列上4個(gè)不同的點(diǎn)進(jìn)行鑒定（對(duì)于前三個(gè) 來(lái)說(shuō)，p〈0. 01，并且對(duì)于第四個(gè)來(lái)說(shuō)，p〈0. 05)。重要的是，當(dāng)將這4個(gè)點(diǎn)的寡核苷酸序列與 454cDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)時(shí)，所有這4個(gè)均與相同的筷子芥屬轉(zhuǎn)錄物達(dá)成BLAST 比對(duì)。因此，不僅已針對(duì)生物噪音對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行校正，此外還檢測(cè)了所有有性基因型和無(wú)融 合生殖基因型的經(jīng)過(guò)顯微解剖的胚珠之間單一差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，在微陣列上對(duì)于特定 基因存在4個(gè)技術(shù)重復(fù)樣品。當(dāng)將二倍體和三倍體無(wú)融合生殖胚珠這兩者與有性胚珠的那 些進(jìn)行比較時(shí)，這個(gè)基因以類似的方式表達(dá)，并且因此它的表達(dá)行為顯然不受倍性的影響。 最終，對(duì)這個(gè)筷子芥屬轉(zhuǎn)錄物的同源物進(jìn)行搜索證實(shí)它涉及其它物種的細(xì)胞周期，因此支 持了有關(guān)使有性途徑失調(diào)作為產(chǎn)生無(wú)融合生殖的手段的證據(jù)。
[0209] 實(shí)施例2:無(wú)融合生殖誘導(dǎo)基因的表征
[0210] 2.a)候選基因表征
[0211] 2.a.i)基因組水平
[0212] 2.a.i.l)克隆
[0213] 使用校正聚合酶（Accuprime)將來(lái)自所有18個(gè)種質(zhì)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物克隆并且測(cè)序 (T0P0-TA克隆試劑盒，英杰公司（Invitrogen))。所述轉(zhuǎn)錄物具有高度多態(tài)性，并且特征在 于在有性體與無(wú)融合生殖體之間單核苷酸多態(tài)性的水平相當(dāng)。盡管如此，在所有10個(gè)無(wú)融 合生殖種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)單"無(wú)融合生殖多態(tài)性"，但在任何有性種質(zhì)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。SEQIDNo. 46 至54示出了三個(gè)有性等位基因，即SOIla、S355a以及S390a的基因組序列和編碼序列。SEQ IDNo.37至45示出了三個(gè)無(wú)融合生殖等位基因，g卩A01la、A043a以及A08la的基因組序列 和編碼序列。在考慮到所有種質(zhì)的地理采集點(diǎn)在加利福尼亞州到美國(guó)中西部的范圍內(nèi)（即 1000千米）的情況下，在所有無(wú)融合生殖體中這種多態(tài)性的共有是高度顯著的。最終，圍繞 "無(wú)融合生殖多態(tài)性"的SNP多態(tài)譜反映了在有性種質(zhì)和無(wú)融合生殖種質(zhì)這兩者中在所有其 它等位基因中所發(fā)現(xiàn)的。因此，"無(wú)融合生殖多態(tài)性"似乎在筷子芥屬進(jìn)化期間進(jìn)行重組，但 盡管如此，它仍由所有的無(wú)融合生殖體所共有，而與不同的遺傳、倍性或地理背景無(wú)關(guān)。
[0214] 2.a.i. 2)BAC
[0215] 使用所有組織種質(zhì)的所匯集的DNA作為模板以產(chǎn)生雜交探針。通過(guò)PCR擴(kuò)增，使 用候選基因基因組序列的兩對(duì)特異性引物來(lái)制備具有不同尺寸（1.6kb和2. 3kb)的兩個(gè)探 針。將這兩個(gè)探針標(biāo)記并且用于在無(wú)融合生殖筷子芥屬BAC文庫(kù)上雜交。存在8個(gè)陽(yáng)性雜 交。對(duì)應(yīng)的分離的BAC(PureLink質(zhì)粒DNA純化試劑盒）被命名為l、2a、2b、3、4、5、6以及 7。使用候選基因的特異性引物重新測(cè)試所選擇的BAC。除BAC-3之外，確認(rèn)了所有的BAC。 通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)對(duì)其它七個(gè)BAC進(jìn)行指紋圖譜分析。BAC-1和BAC-2a似乎與其它 BAC重復(fù)。對(duì)以下BAC進(jìn)行測(cè)序：2b、4、5、6以及7。
[0216] 可將BAC序列組裝在一起形成2b_4和5_7對(duì)，而B(niǎo)AC-6保持單獨(dú)。
[0217] 通過(guò)與其它植物序列進(jìn)行比較來(lái)對(duì)BAC序列進(jìn)行表征。
[0218] 2.a.ii)轉(zhuǎn)錄組水平
[0219]進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)（SMARTerRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒）。
[0220] 結(jié)果揭示對(duì)應(yīng)于無(wú)融合生殖種質(zhì)的mRNA在"無(wú)融合生殖多態(tài)性"上游具有截短的 5'末端，而有性種質(zhì)具有約200pb的額外長(zhǎng)度。
[0221] 在已知5'和3'mRNA末端后，對(duì)所有組織cDNA進(jìn)行進(jìn)一步的PCR以進(jìn)行完全的剪 接譜表征。
[0222] 2.b)驗(yàn)證
[0223] 2.b.i)QRT-PCR
[0224] 完成對(duì)來(lái)自6個(gè)有性和10個(gè)二倍體無(wú)融合生殖筷子芥屬種質(zhì)（每個(gè)種質(zhì)3個(gè)技 術(shù)重復(fù)樣品）的經(jīng)過(guò)顯微解剖的活胚珠（大孢子母細(xì)胞階段）上的候選基因進(jìn)行的等位基 因特異性qRT-PCR分析。使用跨越由基因序列所鑒定的無(wú)融合生殖特異性多態(tài)性的兩種不 同的正向PCR引物，有可能分別對(duì)于有性等位基因和無(wú)融合生殖等位基因這兩者測(cè)量轉(zhuǎn)錄 物豐度。
[0225]使用RevertAidHMinus逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。
[0226] 對(duì)于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，使用SYBR?緑色PCR主混合物（加利福尼亞州福斯特城的 應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems,FosterCity,CA))。在 7900HT快速RT-PCR系 統(tǒng)機(jī)器（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）中使用下列用于SYBR綠色測(cè)定的溫度曲線來(lái)進(jìn)行QRT-PCR 擴(kuò)增：在90 °C下最初變性10分鐘，繼而40個(gè)循環(huán)：95 °C持續(xù)15秒和60 °C持續(xù)1分鐘。為 了檢查擴(kuò)增子質(zhì)量，在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)由產(chǎn)物獲得解鏈曲線梯度。使用Ct作為靶基因的起始拷 貝數(shù)的量度，所述Ct被定義為首先檢測(cè)到報(bào)告基因熒光出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著性增加所處的PCR循 環(huán)。計(jì)算每一種cDNA的每一組三個(gè)技術(shù)重復(fù)樣品的平均表達(dá)水平和標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)比較 AACt法，使用校準(zhǔn)樣品參照管家基因UBQ10的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行所擴(kuò)增的靶標(biāo)的相對(duì)定量 和標(biāo)準(zhǔn)化。
[0227] 結(jié)果是結(jié)論性的：無(wú)融合生殖等位基因僅在所有無(wú)融合生殖種質(zhì)的經(jīng)過(guò)顯微解剖 的胚珠中表達(dá)，而有性等位基因從未在任何（這意指有性或無(wú)融合生殖）胚珠中表達(dá)。這 兩種等位基因均在其它組織，即體細(xì)胞組織中表達(dá)。因此，似乎非常合理地假定有性等位基 因在正常的有性胚珠發(fā)育期間是無(wú)活性的/被沉默，而無(wú)融合生殖等位基因的表達(dá)與無(wú)減 數(shù)胚珠發(fā)育具有相關(guān)性。
[0228] 實(shí)施例3:使用無(wú)融合生殖誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化擬南芥
[0229] 3.a)植物轉(zhuǎn)化
[0230] 使用本發(fā)明的基因?qū)M南芥（有性）（雜種F1)和筷子芥屬（有性）的轉(zhuǎn)化能夠 顯示出它們的繁殖方式變成無(wú)融合生殖種子產(chǎn)生。為此，已經(jīng)將完整基因組等位基因（包 括完整的啟動(dòng)子）克隆進(jìn)PN0S-ABM。
[0231] 此外，使用不同的構(gòu)建體來(lái)對(duì)本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件，特別是本發(fā)明的啟動(dòng)子在它的 表達(dá)中的作用進(jìn)行表征。為此，已經(jīng)使apo啟動(dòng)子和有性啟動(dòng)子這兩者在pGUS-ABM中在gus前面精確地與ATG連接。
[0232] 還使用完整BAC-4進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0233] 實(shí)施例4
[0234] 為了對(duì)本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件進(jìn)行啟動(dòng)子分析，已經(jīng)使用植物PAN軟件（1. 0. 2007版 本）（http://plantpan.mbc.nctu.edu.tw/gene_group/index.php;Chang等人，（2〇〇8)"植 物PAN:用于在植物基因群組中在存在距離限制的情況下鑒定組合順式調(diào)節(jié)元件的植物啟 動(dòng)子分析導(dǎo)航工具（PlantPAN:PlantPromoterAnalysisNavigator,foridentifying combinatorialcis-regulatoryelementswithdistanceconstraintinplantgene group)"，BMCGenomics, 9:561)〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無(wú)融合生殖植物的方法，其包括下列步驟： a) 提供植物細(xì)胞， b) 將所述植物細(xì)胞用含有至少一種外源性核苷酸序列元件的至少一種植物載體轉(zhuǎn)化 以獲得轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包含所述至少一種外源性核苷酸序列元件， 并且所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包含編碼反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子的核苷酸序列、順式作用調(diào) 節(jié)元件、以及在所述順式作用調(diào)節(jié)元件控制下的編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì) 的核苷酸序列，其中所述反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子能夠與所述順式作用調(diào)節(jié)元件相互作 用，并且其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件包含選自以下的至少一種調(diào)節(jié)核苷酸核心序列： SEQIDNo. 66或67中的任一個(gè)的ATHB-5結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 68至73中的任一個(gè) 的UM-I結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 74或75中的任一個(gè)的S0RLIP1AT結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 76 或77中的任一個(gè)的S0RLIP2AT結(jié)合位點(diǎn)、以及SEQIDNo. 78或79中的任一個(gè)的P0LASIG1 結(jié)合位點(diǎn)，以及 c) 使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成表現(xiàn)出無(wú)融合生殖的轉(zhuǎn)基因植物。2. 根據(jù)前述權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件是轉(zhuǎn)基 因順式作用調(diào)節(jié)元件。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中將步驟a)中所提供的所述植物 細(xì)胞在步驟b)中用植物載體轉(zhuǎn)化，所述植物載體含有包含所述順式作用調(diào)節(jié)元件的外源 性核苷酸序列元件。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含所述順式作用調(diào)節(jié)元件的 所述外源性核苷酸序列元件另外包含編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸 序列。5. 用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無(wú)融合生殖植物的方法，所述方法特別是根據(jù)權(quán)利要求1所述，其 包括下列步驟： X)提供有性繁殖植物的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含在順式作用調(diào)節(jié)元件控制之下的 編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列， y) 通過(guò)使所述順式作用調(diào)節(jié)元件中所含的并且選自SEQIDNo. 80至85中的任一個(gè)的 至少一種調(diào)節(jié)核苷酸靶序列突變來(lái)對(duì)控制所述編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì) 的核苷酸序列的所述順式作用調(diào)節(jié)元件進(jìn)行修飾，以及 z) 使在步驟y)中所獲得的植物細(xì)胞再生成表現(xiàn)出無(wú)融合生殖的轉(zhuǎn)基因植物，所述植 物細(xì)胞含有所述至少一種調(diào)節(jié)核苷酸靶序列的缺失。6. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件中所含的所述核苷酸靶序 列是Dof2、Dof3或PBF的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。7. 用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無(wú)融合生殖植物的方法，所述方法特別是根據(jù)前述權(quán)利要求中任一 項(xiàng)所述，其包括下列步驟： m) 提供有性繁殖植物的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含在順式作用調(diào)節(jié)元件控制之下的 編碼具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列， n) 通過(guò)形成至少一種調(diào)節(jié)核苷酸核心序列來(lái)對(duì)控制所述編碼具有DEDDh核酸外切酶 活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的所述順式作用調(diào)節(jié)元件進(jìn)行修飾，所述調(diào)節(jié)核苷酸核心序 列將被包含在所述順式作用調(diào)節(jié)元件中并且選自以下：SEQIDNo. 66或67中的任一個(gè)的 ATHB-5結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 68至73中的任一個(gè)的UM-I結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 74或75 中的任一個(gè)的SORLIPIAT結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 76或77中的任一個(gè)的S0RLIP2AT結(jié)合位 點(diǎn)、以及SEQIDNo. 78或79中的任一個(gè)的P0LASIG1結(jié)合位點(diǎn)，以及 〇)使在步驟n)中所獲得的植物細(xì)胞再生成表現(xiàn)出無(wú)融合生殖的轉(zhuǎn)基因植物，所述植 物細(xì)胞含有新形成的至少一種調(diào)節(jié)核苷酸核心序列。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將步驟a)、x)或m)中所提供的所述 植物細(xì)胞用植物載體轉(zhuǎn)化，所述植物載體含有包含編碼反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子的核苷 酸序列的外源性核苷酸序列元件。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子是過(guò) 表達(dá)的反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反式作用無(wú)融合生殖效應(yīng)子是 轉(zhuǎn)錄因子，特別是ATHB-5、UM-1、S0RLIP1AT、S0RLIP2AT或P0LASIG。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼具有DEDDh核酸外切酶活 性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包含選自以下的核苷酸序列：al)SEQIDNo. 22至54中的任一個(gè) 中所限定的多核苷酸或其完全互補(bǔ)鏈；bl)編碼具有SEQIDNo. 1至21中的任一個(gè)中所限 定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互補(bǔ)鏈；以及cl)與al)或bl)中所限定的所 述核酸序列具有大于70%的序列同一性程度的多核苷酸變體或其完全互補(bǔ)鏈。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼具有DEDDh核酸外切酶活 性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包含選自以下的核苷酸序列：a2)SEQIDNo.22、23、27、28、32、33 中的任一個(gè)中所限定的多核苷酸或其完全互補(bǔ)鏈；b2)編碼具有SEQIDNo. 4、5、6中的任 一個(gè)中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互補(bǔ)鏈；以及c2)與a2)或b2)中 所限定的所述核酸序列具有大于70%的序列同一性程度的多核苷酸變體或其完全互補(bǔ)鏈。13. 用于鑒定植物中的無(wú)融合生殖效應(yīng)子的方法，其中在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定中使 用選自以下的核苷酸序列以鑒定與所述核苷酸序列結(jié)合的蛋白質(zhì)：SEQIDNo. 66或67 中的任一個(gè)的ATHB-5結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 68至73中的任一個(gè)的UM-I結(jié)合位點(diǎn)、SEQ IDNo. 74或75中的任一個(gè)的S0RLIP1AT結(jié)合位點(diǎn)、SEQIDNo. 76或77中的任一個(gè)的 S0RLIP2AT結(jié)合位點(diǎn)以及SEQIDNo. 78或79中的任一個(gè)的P0LASIG1結(jié)合位點(diǎn)。14. 轉(zhuǎn)基因無(wú)融合生殖植物，所述轉(zhuǎn)基因無(wú)融合生殖植物是通過(guò)權(quán)利要求1至13中任 一項(xiàng)所述的方法中的任一種所產(chǎn)生的。15. 轉(zhuǎn)基因植物材料，所述轉(zhuǎn)基因植物材料來(lái)自權(quán)利要求14所述的植物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)植物的無(wú)融合生殖的方法、用于產(chǎn)生無(wú)融合生殖植物的方法以及由其獲得的植物和植物種子。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/00, C12N9/22
【公開(kāi)號(hào)】CN104903452
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380062634
【發(fā)明人】蒂莫西·沙貝勒, 喬斯·M·科拉
【申請(qǐng)人】萊布尼茨植物遺傳學(xué)和作物研究所（Ipk）
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2013年11月27日
【公告號(hào)】CA2892561A1, EP2925868A1, US20150299727, WO2014083047A1