或RNA構(gòu)成。載體可以源自于任何來源。這種 載體優(yōu)選地能夠?qū)⒄{(diào)節(jié)元件，例如啟動子片段，以及本發(fā)明的用于在植物中誘導無融合生 殖的呈正義取向或反義取向的核酸分子，優(yōu)選地DNA序列連同適當?shù)?'端非翻譯序列一起 引入到細胞中，特別是植物細胞中。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"載體"與術(shù)語"植物載體" 可互換使用。
[0157] 術(shù)語"表達"指的是內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在植物中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0158] "標記基因"通常編碼選擇或篩選性狀。因此，"選擇標記基因"的表達給予細胞以 選擇優(yōu)勢，這可能是由于與未轉(zhuǎn)化的細胞的生長相比，它們能夠在負選擇試劑，如抗生素或 除草劑的存在下生長。與未轉(zhuǎn)化的細胞相比，轉(zhuǎn)化的細胞所具有的選擇優(yōu)勢還可能是由于 它們提高的或新型的利用所添加的化合物作為營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子或能量來源的能力。選 擇標記基因還指的是基因或基因的組合，所述基因或基因的組合在植物細胞中的表達給予 細胞以負選擇優(yōu)勢和正選擇優(yōu)勢這兩者。另一方面，"篩選標記基因"不向轉(zhuǎn)化細胞賦予選 擇優(yōu)勢，但它的表達使得轉(zhuǎn)化細胞在表型上不同于未轉(zhuǎn)化的細胞。
[0159] 術(shù)語"在胚囊附近表達"指的是在心皮、珠被、胚珠、胚珠原基、子房壁、合點、珠心、 珠柄或胎座中表達。術(shù)語"珠被"指的是由其衍生的組織，如內(nèi)種皮。術(shù)語"胚芽發(fā)生"指 的是細胞在允許條件下發(fā)育成胚芽的能力。
[0160] 術(shù)語"植物"指的是任何植物，但特別是種子植物。
[0161] 術(shù)語"轉(zhuǎn)基因植物"或"轉(zhuǎn)基因植物細胞"或"轉(zhuǎn)基因植物材料"指的是特征在于存 在本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸變體的植物、植物細胞或植物材料，所述多核苷酸或多核 苷酸變體在它是所述植物自體的情況下與在所述植物、植物細胞或植物材料中所通常存在 的相比可以位于另一位置處或沿另一取向，或?qū)τ谒鲋参?、植物細胞或植物材料來說是 異源的。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞或植物材料表達所述多核苷酸或它的變體以誘 導無融合生殖。
[0162] 術(shù)語"植物細胞"描述了植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，并且包含原生質(zhì)體和細胞壁。植 物細胞可以呈分離的單細胞的形式，如氣孔保衛(wèi)細胞或培養(yǎng)的細胞，或作為更高度組織的 單元（例如像植物組織或植物器官）的一部分。
[0163] 術(shù)語"植物材料"包括植物部分，特別是植物細胞、植物組織，特別是植物繁殖材 料，優(yōu)選地葉片、莖、根、萌發(fā)的胚根、花或花部分、花瓣、果實、花粉、花粉管、花絲、胚珠、胚 囊、卵細胞、子房、合子、胚芽、合子胚本身、體細胞胚、胚軸切段、頂端分生組織、維管束、中 柱鞘、種子、根、插條、細胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其它部分或產(chǎn)物。
[0164]因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的植物繁殖材料。所述"植物繁殖材 料"被理解成是可以在體內(nèi)或體外以有性方式或無性方式繁殖的任何植物材料。在本發(fā)明 的范圍內(nèi)特別優(yōu)選的是由轉(zhuǎn)基因植物獲得的原生質(zhì)體、細胞、愈傷組織、組織、器官、種子、 胚芽、花粉、卵細胞、合子以及任何其它繁殖材料。源自于先前借助于本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化并 且因此至少部分地由轉(zhuǎn)基因細胞組成的轉(zhuǎn)基因植物或它們的后代的植物部分，例如花、莖、 果實、葉片、根也是本發(fā)明的目的。特別優(yōu)選的植物材料，特別是植物繁殖材料是無融合生 殖種子。
[0165] 特別優(yōu)選的植物是單子葉植物或雙子葉植物。特別優(yōu)選的是作物或農(nóng)業(yè)植物，如 向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、卷心菜、花椰菜、西蘭花、蕪 菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、芹菜、胡蘿卜、西萌蘆、南瓜、綠皮西萌蘆、黃瓜、蘋果、梨、 甜瓜、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、大麻屬（Cannabis)、律草屬（Humulus)(啤酒花）、番 前、高粱、甘鹿、以及不結(jié)果的樹，如白楊、橡膠、泡桐屬（Paulownia)、松樹、榆樹、黑麥草屬 (Lolium)、羊茅屬（Festuca)、鴨茅屬（Dactylis)、紫花苜蓿、紅花、煙草、木薯、咖啡、椰子、 菠蘿、柑橘樹、可可、茶葉、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果樹、澳大利 亞堅果（macadamia)、杏仁、青豆、利馬豆、豌豆、冷杉、鐵杉、云杉、紅杉，特別是玉米、小麥、 大麥、高粱、黑麥、燕麥、草坪草以及飼用牧草、粟、水稻以及甘蔗。特別優(yōu)選的是玉米、小麥、 高粱、黑麥、燕麥、草坪草以及水稻。
[0166] 特別優(yōu)選的還有觀賞植物，如觀賞花丼和觀賞作物，例如秋海棠（Begonia)、 康乃馨（Carnation)、菊花（Chrysanthemum)、大_花（Dahlia)、梔子（Gardenia)、蘆輿 (Asparagus)、天竺葵（Geranium)、雛菊（Daisy)、唐菖蒲（Gladiolus)、矮牽牛（Petunia)、 絲石竹（Gypsophila)、百合（Lilium)、風信子（Hyacinth)、蘭花（Orchid)、薔薇（Rose)、 郁金香（Tulip)、單藥花（Aphelandra)、蜘蛛抱蛋（Aspidistra)、橡木（Aralia)、君子蘭 (Clivia)、彩葉（Coleus)、朱蕉（Cordyline)、仙客來（Cyclamen)、龍血樹（Dracaena)、花 葉萬年青（Dieffnbachia)、格樹（Ficus)、喜林芋（Philodendron)、一品紅（Poinsettia)、 蕨類（Fern)、常春藤（Ivy)、八仙花（Hydrangea)、補血草（Limonium)、龜背竹（Monstera)、 棕櫚（Palm)、賽椰樹（Date-palm)、Potho、合果芋（Singonio)、紫羅蘭（Violet)、黃水仙 (Daffodil)、熏衣草（Lavender)、百合（Lily)、水仙（Narcissus)、藏紅花（Crocus)、鸞尾 (Iris)、牡丹（Peonies)、蔥蘭（Zephyranthes)、花燭（Anthurium)、大巖桐（Gloxinia)、杜 雨$ 花（Azalea)、藿香（Ageratum)、竹（Bamboo)、山茶（Camellia)、石竹（Dianthus)、鳳仙 (Impatien)、半邊蓮（Lobelia)、天竺葵（Pelargonium)、紫丁香（Lilac)、鈴蘭（Lilyofthe Valley)、千金子藤（Stephanotis)、八仙花、向日葵（Sunflower)、非洲菊（Gerberdaisy)、 酢衆(zhòng)草（Oxalis)、萬壽菊（Marigold)以及木槿（Hibiscus)。
[0167] 在雙子葉植物當中，擬南芥屬、筷子芥屬、大豆、棉花、糖用甜菜、油菜、煙草、胡椒、 甜瓜、萬苣、甘藍類蔬菜（Brassicavegetable)，特別是甘藍型油菜（Brassicanapus)、糖 用甜菜、油菜以及向日葵在本文中是更優(yōu)選的。
[0168]"轉(zhuǎn)化（transformation) "、"轉(zhuǎn)化（transforming) "以及"轉(zhuǎn)移"指的是將核酸分 子，特別是DNA轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，包括但不限于生物射彈法，如粒子轟擊、顯微注射、使 用各種物理處理（例如電穿孔）或化學處理（例如聚乙二醇或PEG處理）使細胞膜透化；原 生質(zhì)體的融合或根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes)介導的轉(zhuǎn)化。對于在植物細胞中進行DNA的注射和電穿孔，對所用的質(zhì)粒不 存在特定的要求?？梢允褂弥T如PUC衍生物之類的質(zhì)粒。如果整體植物要從這些轉(zhuǎn)化的細 胞再生，那么使用選擇標記是優(yōu)選的。根據(jù)用于將所需基因引入到植物細胞中的方法，另外 的DNA序列可能是必要的；如果例如使用Ti或Ri質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化植物細胞，那么Ti和Ri質(zhì)粒 T-DNA的至少右邊界，然而常常是右邊界和左邊界必須作為側(cè)接區(qū)域與所要引入的基因連 接。優(yōu)選地，所轉(zhuǎn)移的核酸分子被穩(wěn)定地整合到受體植物的基因組或質(zhì)體系中。
[0169] 在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)了解的是，"轉(zhuǎn)化"植物細胞指的是轉(zhuǎn)化過程本身以及轉(zhuǎn) 基因（意指外源性）核苷酸序列在植物細胞的基因組中的后續(xù)穩(wěn)定的整合。
[0170] 措辭"后代"或"子代"指的是轉(zhuǎn)基因植物的"以無性方式"和"以有性方式"產(chǎn)生 的后代這兩者。這個定義還意指包括可借助于諸如細胞融合或突變體選擇之類的已知方法 獲得的并且仍表現(xiàn)出本發(fā)明的最初轉(zhuǎn)化的植物的特征性特性的所有突變體和變體，以及轉(zhuǎn) 化的植物材料的所有雜交和融合產(chǎn)物。這還包括由回交產(chǎn)生的后代植物，只要所述后代植 物仍含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽即可。
[0171] 本發(fā)明中所用的分離的核酸分子優(yōu)選地是特定基因組或cDNA序列分子中的DNA， 優(yōu)選地來自植物，優(yōu)選地來自十字花科植物，特別是筷子芥屬，特別是霍氏筷子芥、迪瓦氏 筷子芥（Boecheradivaricarpa)或直立筷子芥（Boecherastricta)的DNA。然而，它還可 以是RNA，特別是mRNA。
[0172] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還使用植物載體，所述植物載體包含根據(jù)本發(fā)明的 核酸序列中的任一種。本發(fā)明中所用的特異性多核苷酸或多核苷酸變體這兩者可以被包含 在所述載體中與調(diào)節(jié)元件呈正義或反義取向。
[0173] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，所述植物載體包含能夠用作與需要在植物，特別 是植物胚珠中表達的蛋白質(zhì)編碼核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)元件的多核苷酸，特別是本 發(fā)明的順式作用調(diào)節(jié)元件。
[0174] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還使用宿主細胞，所述宿主細胞含有本發(fā)明的載體。
[0175] 本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的至少一種核酸分子或本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)基因 植物、植物細胞、植物材料，特別是植物種子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供了包含根 據(jù)本發(fā)明的細胞的細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選地植物細胞培養(yǎng)物。
[0176] 在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物材料，特別 是植物種子，其中多核苷酸、多肽或其變體表現(xiàn)出它的生物功能。在本發(fā)明的具體的實施方 案中，提供了植物或植物種子，所述植物或植物種子包含本發(fā)明的多核苷酸、多肽或其變體 并且由于所述多核苷酸或多肽或其變體的存在而顯示出無融合生殖。
[0177] 雖然借助于通過本發(fā)明多核苷酸的異源表達產(chǎn)生無融合生殖種子具體描述了本 發(fā)明，但將認識到本發(fā)明的多核苷酸的變體同樣可以表達而獲得類似的結(jié)果，所述變體的 產(chǎn)物具有類似的結(jié)構(gòu)和功能。此外，盡管實施例說明了筷子芥屬和擬南芥屬植物的無融合 生殖種子產(chǎn)生，但是當然，本發(fā)明不限于無融合生殖種子誘導基因僅在這些植物中表達。
[0178] 本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方案是從屬權(quán)利要求的主題。
[0179] 附圖示出了：
[0180] 圖1:在所有apo等位基因中并且僅在apo等位基因中出現(xiàn)的正鏈中的無融合生 殖特異性TBS。
[0181] 圖2 :在所有apo等位基因中并且僅在apo等位基因中出現(xiàn)的負鏈中的無融合生 殖特異性TBS。
[0182] 圖3 :在所有apo等位基因中并且僅在apo等位基因中出現(xiàn)的負鏈中的無融合生 殖特異性TBS。
[0183] 圖4 :在所有的有性等位基因中并且僅在有性等位基因中出現(xiàn)的負鏈中的有性特 異性TBS。
[0184] 現(xiàn)在將借助于實施例來說明本發(fā)明。
[0185] 實施例1 :無融合生殖誘導基因（apollo基因）的篩選和分離
[0186] 1.a)植物材料和種子篩選分析
[0187] 使植物在人工氣候室中在受控的環(huán)境條件下從幼苗開始生長。使用流式細胞術(shù)種 子篩選對18種筷子芥屬種質(zhì)中的繁殖變異性進行分析（表IV)。
[0188] 表IV:在微陣列和RT-PCR分析中所用的筷子芥屬種質(zhì)。
[0189]
[
[0191]使用Geno-Grinder2000(SPEXCerti-Pr?。┮?150 次 / 分鐘的速率將單一的 種子在容納50y1的提取核分離緩沖液（參見下文）的96孔培養(yǎng)板（PP-Master-block 128. 0/85MM，1. 0ml96 孔培養(yǎng)板，Greinerbi〇-〇ne公司，www.gbo.com)的每一個孔中用三 個2. 3mm不銹鋼珠單獨地研磨90秒。
[0192] 使用兩步程序，所述兩步程序由分離緩沖液和染色緩沖液組成：(a)分離緩沖液 I:溶解在H20中并且被調(diào)節(jié)到pH2. 5的0. 1M檸檬酸一水合物和0. 5 %v/v吐溫20(Tween 20);以及〇3)染色緩沖液11:溶解在1120(加上41^/11114'，6-二脒基苯基吲哚咖?1))中 并且被調(diào)節(jié)到pH8. 5的0. 4MNa2HP04. 12H20。在研磨之前將50y1的分離緩沖液I添加到 96孔培養(yǎng)板中的每孔每一個種子中，并且在研磨之后再添加160y1緩沖液I以經(jīng)由過濾 (使用Partec30ym網(wǎng)孔寬度尼龍過濾器）回收足夠的體積。然后將100yl染色緩沖液 II添加到50y1的所得懸浮液（分離的核）中，并且在冰上孵育10分鐘，之后進行流式細 胞術(shù)分析。為了避免樣品在對96種樣品進行分析所需的2小時的時間段內(nèi)降解，使用鋁密 封帶將樣品培養(yǎng)板密封。
[0193] 在掛接到PartecPAII流式細胞儀（德國明斯特的Partec有限公司（Partec GmbH,MUnster,Germany))的4°C冷卻的Robby-Well自動進樣器上分析所有樣品培養(yǎng)板。來 自SAD12(-種已知的有性自花受精筷子芥屬）的兩個單一的種子始終作為外部參考被包 括在孔位置1和96處以在分析時間段內(nèi)對其它峰進行標準化并且校正峰移位。SAD12種 子僅由2C胚芽：3C胚乳比率構(gòu)成，這反映了C(C表示單倍體DNA含量）母本（Cm)基因組 +C父本（Cp) = 2C基因組的胚芽組成和2Cm+Cp= 3C的胚乳組成。
[0194] 基于本發(fā)明的高通量流式細胞術(shù)種子篩選數(shù)據(jù)，所有無融合生殖種質(zhì)均被證實特 征在于100%無融合生殖種子產(chǎn)生。
[0195] 1. b)胚珠顯微解剖
[0196] 選擇處在2-II期至2-IV期之間的大孢子發(fā)生時的胚珠（其中大孢子母細胞分 化，內(nèi)珠被和外珠被開始發(fā)生）以研宄與減數(shù)分裂和無減數(shù)無配子生殖相關(guān)的基因表達 的變化。在數(shù)天內(nèi)在標準化的時間（上午8點到9點），在0. 55M無菌甘露醇溶液中將 有性筷子芥屬和無融合生殖筷子芥屬的雌蕊在大孢子發(fā)生階段從未被授粉的花中解剖 出。在無菌空氣層流柜中使用立體顯微鏡（lOOOStemi，德國耶拿的卡爾蔡司公司（Carl Zeiss,Jena,Germany))在2倍放大倍數(shù)下進行顯微解剖。使用鉗子固定雌蕊，同時使用無 菌解剖刀縱向切割以使得長角果以及胚珠的兩半立即暴露于甘露醇。隨后在倒置顯微鏡 (Axiovert200M，卡爾蔡司公司）下在無菌條件中，使用無菌玻璃針（使用NarishigePC10 牽拉工具自制，并且被彎到約100°的角度）以從胎座組織分離胚珠來采集單個活胚珠。使 用接口于EppendorfCellTramVario手動顯微注射儀的玻璃毛細管（具有150ym內(nèi)徑的 開口），將胚珠采集在容納l〇〇yl的RNA穩(wěn)定化緩沖液（RNAlater，西格瑪公司（Sigma)) 的無菌微量離心管中。以這種方式采集每個種質(zhì)20至40個胚珠，直接在液氮中冷凍并且 儲存在_80°C。
[0197]l.c)胚珠RNA分離
[0198] 使用PicoPureRNA分離試劑盒（加利福尼亞州的ArcturusBioscience公司 (ArcturusBioscience，CA))進行總RNA提取。在Agilent2100生物分析儀上使用RNA Pico芯片（加利福尼亞州帕洛阿爾托的安捷倫科技公司（AgilentTechnologies,Palo Alto,CA)驗證RNA完整性和量。
[0199] l.d)微陣列
[0200] 1.di)微陣列設(shè)計
[0201] 使用454 (FLX)技術(shù)對3種有性和3種無融合生殖筷子芥屬種質(zhì)的完全轉(zhuǎn)錄組進 行測序，作為設(shè)計用于比較基因表達和拷貝數(shù)變異的高密度筷子芥屬特異性微陣列的第一 步。轉(zhuǎn)錄組測序的目標因此在于鑒定可以在花發(fā)育期間表達的所有基因，繼而將所有所鑒 定的基因點樣到（Agilent)微陣列上。
[0202] 這是通過以下來實現(xiàn)的：對