以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及益生菌微膠囊制備方法，具體涉及以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益 生菌微膠囊的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌常因高強度的生產(chǎn)加工而大量失活，常規(guī)添加手段不能保護益生菌免受喂 飼過程的胃酸、膽鹽以及消化酶等的作用，導(dǎo)致活菌數(shù)大幅下降，因此很難有足夠數(shù)量的活 菌到達腸道并定居于腸黏膜上而發(fā)揮其生理功能。包埋是提高益生菌活性的一種有效方 法。研宄發(fā)現(xiàn)微膠囊包埋技術(shù)是最好方法之一，并成為目前國內(nèi)外研宄的熱點。
[0003] 微膠囊技術(shù)是一種用成膜材料（即壁材）把某種物質(zhì)（即芯材）包覆并使之形成微 小粒子的技術(shù)，得到的微小粒子叫做微膠囊，其粒徑一般在微米到毫米范圍。微膠囊技術(shù)最 大的特點是芯材可根據(jù)需要在恰當(dāng)?shù)臅r間和位置以一定的速率進行釋放。采用腸溶性壁材 后，能防止胃液的破壞，而使盡可能多的菌體到達腸道，真正起到保健和治療的作用。益生 菌微膠囊化常用的方法是擠壓法、乳化法、噴霧干燥法、復(fù)凝聚法和淀粉粘附法等。
[0004] 微膠囊包埋存在的問題除了制備方法外，壁材的選用成為關(guān)鍵，目前一般選用如 海藻酸鈉、明膠等有機高分子材料。凹凸棒石粘土簡稱凹土，是一種天然非金屬粘土礦物， 具有較好吸附性、膠體性、粘結(jié)性、催化性等。凹土富含生物活性物質(zhì)，可作為益生菌載體制 備益生菌制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于：提供一種以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方 法，以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土作為壁材，既發(fā)揮靶向性和控釋性方面的優(yōu)異性能，又提高 其機械強度，該膠囊提高益生菌制備過程中的存活率以及經(jīng)過胃環(huán)境到達腸的存活率。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：該方法首先是純化凹土，其次將凹土與海藻酸鈉、明膠 混合成復(fù)合壁材，接著將已制備好的益生菌菌懸液在一定的條件下與上述復(fù)合壁材混合均 勻，然后緩慢滴入CaCl 2中固化成型，最后真空冷凍法干燥，獲得益生菌微膠囊。
[0007] 本發(fā)明的制備方法包括以下具體步驟： 第一步凹土的純化：將凹土采用電導(dǎo)率低于5 μ s/cm的去離子水浸泡20~28h，攪拌器 以1000~1500rpm轉(zhuǎn)速攪拌20~28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以其5~20%的量繼續(xù)加 入上述去離子水，同樣操作，重復(fù)2~3次，于105~120°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目 細土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保 加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞鏈球菌、地衣芽孢桿菌或酵母菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期， 收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于PH為2~9的磷酸鹽緩沖體系中， 并將濃度調(diào)節(jié)至l〇 9~l〇lclCFU/ml備用； 第三步壁材與益生菌混合溶液的制備：將5-50g的海藻酸鈉、0-50g的明膠和l-40g的 凹土懸浮至IOL的菌懸液中，混合均勻； 第四步微膠囊固化成型：將上述壁材與益生菌的混合溶液緩慢滴加入離子強度為 0. 01-2mol/L、pH5-8磷酸鹽緩沖液配制的濃度為l-50g/L的CaCl2*，于20-40°C固化成型 10-100分鐘，獲得粒徑大小為100-2000 μ m的微膠囊粒子； 第五步真空冷凍干燥法獲得益生菌微膠囊制劑：真空冷凍干燥法條件為：上述微膠囊 粒子于-40~-75°C預(yù)凍2~3小時，迅速移入冷凍干燥機冷凍干燥20~28小時，使微囊制劑含 水量< 2%，檢測活菌劑中活菌數(shù)為109~1012CFU/g。
[0008] 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉5g， 蒸餾水1000ml，ρΗ7· 2 ;35°C振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0009] 雙歧桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g， NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸餾水 1000ml，pH7 ;35°C靜置培養(yǎng) 22 小時。
[0010] 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫 二銨 2g，葡萄糖 20g，吐溫-80 lml，CH3COONaCH2O 5g，K2HP04*3H20 2g，MgSO4WH2O 0.58g， MnSCVH2O 0· 25g，蒸餾水 1000ml，調(diào) ρΗ6· 2-6. 4 ;37°C靜置培養(yǎng) 20 小時。
[0011] 嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；40°C靜置培養(yǎng)20小時。
[0012] 保加利亞乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。
[0013] 鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。
[0014] 糞鏈球菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸餾水1000ml， pH6. 8 ;37°C振蕩培養(yǎng)6h，搖床轉(zhuǎn)速為lOOrpm。
[0015] 地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g， 蒸餾水1000ml，pH 7· 0 ;37°C振蕩培養(yǎng)40h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0016] 酵母菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然； 28°C振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點是：采用海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊，和單純凹土制 得的活菌制劑在真空冷凍過程中和在人工模擬胃環(huán)境中的存活率要高得多，在人工腸環(huán)境 中能較長時間地維持高活菌水平。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實施例不能理解為 是對技術(shù)方案的限制。
[0019] 實施例1 :依以下步驟制備益生菌微膠囊制劑 第一步凹土的純化：將凹土采用電導(dǎo)率低于5 μ s/cm的去離子水浸泡20h，攪拌器以 1000 rpm轉(zhuǎn)速攪拌20h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以其5%的量繼續(xù)加入上述去離子水， 同樣操作，重復(fù)2次，于105°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目細土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用 無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于pH為2的磷酸鹽緩沖體系中，并將濃度調(diào)節(jié)至 IO9CFUAiI備用；枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯 化鈉5g，蒸餾水1000ml，pH7. 2 ;35°C振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm ; 第三步壁材與益生菌混合溶液的制備：將5g海藻酸鈉和Ig的凹土懸浮至10L的菌懸 液中，混合均勻； 第四步微膠囊固化成型：將上述壁材與益生菌的混合溶液緩慢滴加入離子強度為 0. 01mol/L、pH5磷酸鹽緩沖液配制的濃度為lg/L的CaCl#，于20°C固化成型10分鐘，獲 得粒徑大小為100 μ m大小的微膠囊粒子； 第五步真空冷凍干燥法獲得益生菌微膠囊制劑：真空冷凍干燥法條件為：上述微膠囊 粒子于-40°C預(yù)凍3小時，迅速移入冷凍干燥機冷凍干燥20小時，使微囊制劑含水量< 2%， 檢測活菌劑中活菌數(shù)為l〇9CFU/g。
[0020] 實施例2 :依以下步驟制備益生菌微膠囊制劑 第一步凹土的純化：將凹土采用電導(dǎo)率低于5 μ s/cm的去離子水浸泡21h，攪拌器以 IlOOrpm轉(zhuǎn)速攪拌21h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以其10%的量繼續(xù)加入上述去離子 水，同樣操作，重復(fù)3次，于110°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目細土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將雙歧桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用無 菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于pH為3的磷酸鹽緩沖體系中，并將濃度調(diào)節(jié)至 101(lCFU/ml備用；雙歧桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉 膏 4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸餾水 1000ml，pH7 ;35°C靜置培養(yǎng) 22