C烘干，研磨，過篩，取200目至140目細(xì)土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將地衣芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用 無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于pH為2~9的磷酸鹽緩沖體系中，并將濃度調(diào)節(jié) 至109~10 1(lCFU/ml備用；地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0 ;37°C振蕩培養(yǎng) 40h，搖床轉(zhuǎn)速為 180rpm ; 第三步壁材與益生菌混合溶液的制備：將45g的海藻酸鈉、45g的明膠和35g的凹土懸 浮至IOL的菌懸液中，混合均勻； 第四步微膠囊固化成型：將上述壁材與益生菌的混合溶液緩慢滴加入離子強(qiáng)度為 0. 01mol/L、pH8磷酸鹽緩沖液配制的濃度為45g/L的CaCl2*，于30°C固化成型85分鐘， 獲得粒徑大小為1000 μ m大小的微膠囊粒子； 第五步真空冷凍干燥法獲得益生菌微膠囊制劑：真空冷凍干燥法條件為：上述微膠囊 粒子于-75°C預(yù)凍3小時，迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥27小時，使微囊制劑含水量< 2%， 檢測活菌劑中活菌數(shù)為l〇12CFU/g。
[0027] 實(shí)施例9 :依以下步驟制備益生菌微膠囊制劑 第一步凹土的純化：將凹土采用電導(dǎo)率低于5 μ s/cm的去離子水浸泡28h，攪拌器以 1500rpm轉(zhuǎn)速攪拌28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以其20%的量繼續(xù)加入上述去離子 水，同樣操作，重復(fù)3次，于120°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目細(xì)土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將酵母菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用無菌生 理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于pH為9的磷酸鹽緩沖體系中，并將濃度調(diào)節(jié)至IOltlCFU/ ml備用；酵母菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然； 28°C振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm ; 第三步壁材與益生菌混合溶液的制備：將50g的海藻酸鈉、50g的明膠和40g的凹土懸 浮至IOL的菌懸液中，混合均勻； 第四步微膠囊固化成型：將上述壁材與益生菌的混合溶液緩慢滴加入離子強(qiáng)度為 2mol/L、pH8磷酸鹽緩沖液配制的濃度為50g/L的CaCl2*，于40°C固化成型100分鐘，獲 得粒徑大小為2000 μ m大小的微膠囊粒子； 第五步真空冷凍干燥法獲得益生菌微膠囊制劑：真空冷凍干燥法條件為：上述微膠囊 粒子于-75°C預(yù)凍2小時，迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥28小時，使微囊制劑含水量< 2%， 檢測活菌劑中活菌數(shù)為l〇nCFU/g。
[0028] 實(shí)施例1-9的數(shù)據(jù)如表1和表2所不。
[0029] 表1益生菌制劑存活率比較
表2益生菌制劑在人工模擬胃環(huán)境（3h)存活率比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，該方法首先是純化凹土，其次 將凹土與海藻酸鈉、明膠混合成復(fù)合壁材，接著將已制備好的益生菌菌懸液在一定的條件 下與上述復(fù)合壁材混合均勻，然后緩慢滴入CaCl2中固化成型，最后真空冷凍法干燥，獲得 益生菌微膠囊；其特征是該制備方法包括以下具體步驟： 第一步凹土的純化：將凹土采用電導(dǎo)率低于5ys/cm的去離子水浸泡20~28h，攪拌器 以1000~1500rpm轉(zhuǎn)速攪拌20~28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以其5~20%的量繼續(xù)加 入上述去離子水，同樣操作，重復(fù)2~3次，于105~120°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目 細(xì)土備用； 第二步益生菌菌懸液的制備：將枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保 加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞鏈球菌、地衣芽孢桿菌或酵母菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期， 收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，將菌體懸浮于PH為2~9的磷酸鹽緩沖體系中， 并將濃度調(diào)節(jié)至l〇9~l〇lclCFU/ml備用； 第三步壁材與益生菌混合溶液的制備：將5-50g的海藻酸鈉、0-50g的明膠和l-40g的 凹土懸浮至IOL的菌懸液中，混合均勻； 第四步微膠囊固化成型：將上述壁材與益生菌的混合溶液緩慢滴加入離子強(qiáng)度為 0. 01-2mol/L、pH5-8磷酸鹽緩沖液配制的濃度為l-50g/L的CaCl2*，于20-40°C固化成型 10-100分鐘，獲得粒徑大小為100-2000ym的微膠囊粒子； 第五步真空冷凍干燥法獲得益生菌微膠囊制劑：真空冷凍干燥法條件為：上述微膠囊 粒子于-40~-75°C預(yù)凍2~3小時，迅速移入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥20~28小時，使微囊制劑含 水量< 2%，檢測活菌劑中活菌數(shù)為109~1012CFU/g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化鈉5g，蒸餾 水1000ml，pH7. 2 ;35°C振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是雙歧桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HPO4 2. 5g，蒸餾水 1000ml，pH7 ;35°C靜置培養(yǎng) 22 小時。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其 特征是嗜酸乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨l〇g，牛肉膏l(xiāng)〇g，酵母膏5g，檸檬酸氫二 銨 2g，葡萄糖 20g，吐溫-80lml，CH3COONaCH2O5g，K2HPO4CH2O2g，MgSO4WH2O0.58g， MnSCVH2O0? 25g，蒸餾水 1000ml，調(diào)pH6. 2-6. 4 ;37°C靜置培養(yǎng) 20 小時。5. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；40°C靜置培養(yǎng)20小時。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是保加利亞乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是糞鏈球菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 ; 37°C振蕩培養(yǎng)6h，搖床轉(zhuǎn)速為lOOrpm。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 2g，蒸餾 水1000ml，pH7. 0 ;37°C振蕩培養(yǎng)40h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，其特 征是酵母菌培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然；28°C 振蕩培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土制備益生菌微膠囊的方法，該方法首先是純化凹土，其次將凹土與海藻酸鈉、明膠混合成復(fù)合壁材，接著將已制備好的益生菌菌懸液在一定的條件下與上述復(fù)合壁材混合均勻，然后緩慢滴入CaCl2中固化成型，最后真空冷凍法干燥，獲得益生菌微膠囊；本發(fā)明以海藻酸鈉、明膠復(fù)合凹土作為壁材，既發(fā)揮靶向性和控釋性，又提高其機(jī)械強(qiáng)度，該膠囊提高益生菌制備過程中的存活率以及經(jīng)過胃環(huán)境到達(dá)腸的存活率。
【IPC分類】C12N11/10, C12R1/23, C12R1/01, C12R1/10, C12R1/225, C12R1/125, C12R1/46
【公開號】CN104911171
【申請?zhí)枴緾N201510269485
【發(fā)明人】趙玉萍, 蔣長興, 游慶紅, 方芳
【申請人】淮陰工學(xué)院
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月25日