甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其應(yīng)用
【專利說明】甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】 人參（Panax ginsengC.A. Mey)為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是 我國的名貴藥材,有草之王"的美譽(yù)。人參在中國、韓國、朝鮮、俄羅斯等國家有大面積 種植，其中，中國東北是人參的主產(chǎn)區(qū)，已成為當(dāng)?shù)氐闹匾еa(chǎn)業(yè)之一。人參的長期人工 種植,且品種選育難度大導(dǎo)致人參種質(zhì)退化、病害嚴(yán)重、質(zhì)量差、產(chǎn)量低?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使 用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，降低了人參藥材的安全性和商品價(jià)值。病害防控問題已成為 制約人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題之一。 人參病害約有20~40種,其中，以下5類病原菌是導(dǎo)致人參常見病害并限制人參產(chǎn)業(yè) 發(fā)展的主要病原菌：腐皮鐮孢菌（Fusarium solani)導(dǎo)致的人參根腐病一般發(fā)病率在30% 左右，嚴(yán)重時(shí)六年生人參根腐病造成的死亡率可達(dá)50%~80%,主要危害幼苗根部和根莖 部（地表以下莖部），腐爛的參根呈黑褐色濕腐狀，后期糟朽狀，僅存中空的根皮；惡疫霉 菌（Phytophthora cactonun)導(dǎo)致的人參疫病發(fā)柄率達(dá)70%，其癥狀為發(fā)病輕時(shí)葉片' 上產(chǎn)生不規(guī)則的暗綠色斑，重者莖葉枯萎，根部腐爛，植株成片枯死，減產(chǎn)嚴(yán)重；人參核盤菌 (Sclerotinia schinseng)導(dǎo)致的人參菌核病主要危害3年生以上參根,發(fā)病部位為芽苞、 根和根莖，參根侵染后，初期在表面生少許白色絨狀菌絲體，以后，內(nèi)部迅速腐敗、軟化,細(xì) 胞全部被消解殆盡,只留下壞死的外表皮，表皮內(nèi)外形成許多鼠糞狀的菌核；人參鏈格孢菌 (Alternaria panax)導(dǎo)致的人參黑斑病一般發(fā)病率20%-30%,嚴(yán)重時(shí)達(dá)到100%，造成早 期落葉，植株枯萎，不結(jié)實(shí)，參根和參籽減產(chǎn)；毀滅柱孢菌（!Cylindrocarpon destructans) 導(dǎo)致的人參銹腐病嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率達(dá)70%以」::。該病發(fā)生于根的各部位，病斑呈鐵銹色，H點(diǎn) 至面擴(kuò)散至全根,土壤濕度大、透氣不好、腐殖質(zhì)層厚，發(fā)病重。 校期以來通過使用化學(xué)農(nóng)藥等化學(xué)防治措施來防治人參病害的結(jié)果遠(yuǎn)未達(dá)到人們預(yù) 想的效果，而且過量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)破壞土壤的微生態(tài)環(huán)境，加重環(huán)境污染,也使有毒物質(zhì) 在參根內(nèi)大量積累，降低人參的使羯安全性和商品價(jià)值，因此，人們把防治重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向生 物防治措施和農(nóng)業(yè)防治措施上。在農(nóng)作物植物保護(hù)領(lǐng)域,利用作物根際土壤篩選對(duì)病原菌 具有顯著拮抗效果的土壤微生物，并制成生物菌劑是生物防控研究的重要手段,也是有益 微生物資源開發(fā)的重要途徑。 生物防治是以生態(tài)學(xué)原理為基礎(chǔ)，利用生物物種間的相互作用，以一種或一類生物抑 制另一種或另一類生物。生物防治最大的優(yōu)點(diǎn)的不污染環(huán)境,沒有農(nóng)藥殘留，這是農(nóng)藥等非 生物方法防治病蟲害所無法比的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技術(shù)的重要 組成部分，它避免了化學(xué)農(nóng)藥使用帶來的一系列植保、環(huán)境和能源方面的問題，避免了農(nóng)藥 殘留對(duì)人畜的危害,更重要的是促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 芽孢桿菌（Bacinus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物類群，其種類多分 布廣，是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)種群。主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、 解淀粉枯草芽孢桿菌（Bacillus amylolique+faciens)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus met.hylotrophicus)、蠟狀芽孢桿菌（Baci:丨Ius cereus)、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)等。由于芽孢桿菌具有抑制植物病 害的能力，又是自然界+廣泛存在的非致病細(xì)菌，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，因而備受關(guān)注。 美國已有GB03、MBI600、QsIT 13和解淀粉枯草芽孢桿菌變種等4株枯草芽孢桿菌生防菌株 獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。在德國解淀粉枯草芽孢桿菌變種FZB24被 商業(yè)化生產(chǎn),用于控制糧食作物的不同真菌病害。該類微生物通過分泌抗生物質(zhì)和生長競(jìng) 爭(zhēng),在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作羯。目前利用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌防治人參真菌 性病害未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)人參生產(chǎn)上主要真菌性病害，尤其是人參土傳病害發(fā)生面積 日益擴(kuò)大,化學(xué)藥劑防治易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留外，防效也不理想的實(shí)際情況，提出2 個(gè)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus met+hylotrophicus)菌株，分另[]為SZ-3和SZ-81，及其在 分別引起人參的根腐病、黑斑病、菌核病、疫病和銹腐病的腐皮鐮孢菌（Fusarium solani)、 人參鏈格孢菌（Alternaria panax)、人參核盤菌（Sclerotinia schinseng)、惡疫霉菌 (Phytophthora cactoruro)和毀滅柱孢菌（Cylindroca+rpon destructans) 5 種病原菌防控 上的應(yīng)用。 本發(fā)明提供了 2個(gè)對(duì)上述5種病原菌具有良好防控作S的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株， 分別為 Bacillus methylotrophicus SZ-3 和 Bacillus me thy I 〇 troph icus SZ-81,并且 2 個(gè)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株的混合發(fā)酵液對(duì)上述5種人參病原菌的聯(lián)合防控效果史加顯 -自c: 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 上述菌株的物種鑒定是這樣迸行的：通過16SrDNA序列分析,測(cè)定2株細(xì)菌的16Srf)NA 序列長度分別為H64bp和1420bp,具體如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。 其中dBQ丨:]〕No. 1如下所示：
應(yīng)用BLAST軟件和DNAMAN軟件等進(jìn)行分析,將所測(cè)16SrDNA序列通過BLAST比對(duì)，能 在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與SZ-3和SZ-81菌株相似性最高的是 Bacillus屬菌種，同源性達(dá)到99%。根據(jù)MEGA5. 10Beta2軟件以UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 發(fā)現(xiàn)/菌株SZ-3和SZ-81與Bacillus methyIotrophicus同屬一Iv遺傳分枝，親緣關(guān)糸十 分接近,親源性達(dá)到了 99. 2%和99. 3%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的鑒定結(jié)果，可以確 認(rèn)分離到的菌株SZ-3和SZ-81均為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus)。 上述菌株的保臧名稱分別為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ…3和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-~8i,分類 命名分別為 Bacillus methylotrophicus SZ-3 和 Bacillus met+hylotrophicus SZ-81，保 藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào),保藏日期為2013年9月25日，保藏編號(hào)分別為CGMCC No, 8275和CGMCC No, 8276。 即， -種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methy:丨otrophicus)SZ-3,其特征在于，其保藏號(hào) 為 CGMCC No. 8275 ;和 --種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus) SZ-81，其特征在于，其保藏 號(hào)為 CGMCC No, 8276。 本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ…3在牛肉膏蛋白胨（NB)培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長形 成的菌落為圓形，四周光滑,乳白色，表面有光澤,質(zhì)地干燥，具鞭毛；細(xì)胞形狀為桿狀；厭 氧生長；革蘭氏染色呈陽性；接觸酶測(cè)定、脂肪酶反應(yīng)為卩日性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)為陽性； V-P試驗(yàn)和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；能利用D-葡萄糖，D-木糖，L·-阿拉伯糖，甘露醇,不能 利用村I家酸鹽；能水解淀粉和_,;囷株接入到含2% NaCl的NB :1??養(yǎng)液中發(fā)酵24h后混 洩。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81在牛肉膏蛋白胨（NB)培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長形成的菌 落為圓形，四周光滑,乳白色，表面有光澤,質(zhì)地千燥,具鞭毛；細(xì)胞形狀為桿狀；厭氧生長； 革蘭氏染色呈陽性；接觸酶測(cè)定、脂肪酶反應(yīng)為陽性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)為陽性；V…P試驗(yàn) 和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；能利用[)-葡萄糖，D-木糖α-阿拉伯糖，甘露醇,不能利用檸檬 酸鹽；能水解淀粉和明膠；菌株接入到含5% NaCl的NB培養(yǎng)液中發(fā)酵24h后混洩。 所述的牛肉膏蛋白胨（NB)培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3. Og,蛋白胨10.0 g, NaC15. Og,瓊 脂 i7g,水 1000 mU ρΗ6· 8 ~7. 2。 本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81，其特征在于，該菌株在牛肉膏蛋白胨（NB)培養(yǎng) 基上單細(xì)胞繁殖生長形成的菌落為圓形，四周光滑，乳白色,表面有光澤,質(zhì)地干燥,具鞭 毛；細(xì)胞形狀為桿狀；厭氧生長；革蘭氏染色呈陽性；接觸酶測(cè)定、脂肪酶反應(yīng)為陽性；酪 蛋白、酪氨酸反應(yīng)為陽性；V-P試驗(yàn)和硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性；能利用D-葡萄糖，D…木糖， L-阿拉伯糖，甘露醇，小能利用朽酸鹽；能水解淀粉和明膠；國株接入$!|含5% NaCi的NB 培養(yǎng)液中發(fā)酵24h后混洩。 根據(jù)本發(fā)明，所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-Si的NB培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3. Og^ 蛋白胨 10. 0g，NaC15. 0g，瓊脂 17g,水！OOOmU pH6. 8 ~7. 2。 本發(fā)明還涉及上述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ--3或SZ--81在防治植物真菌病害中的應(yīng)用， 或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。所述植物優(yōu)選為人參。其中^甲基營 養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3優(yōu)選用于防治引起人參的根腐病的腐皮鐮孢菌（R solani)、引起人參 黑斑病的人參鏈格孢菌（A. panax)和引起人參菌核病的人參核盤菌（S. schinseng)中的一 種或多種。所述甲基宮養(yǎng)型芽抱桿囷SZ-81優(yōu)選用十防治引起人參疫病的惡&霉國' (Ph, cactorum)、引起人參銹腐病的毀滅柱孢菌（C. destructans)和引起人參黑斑病的人參鏈 格孢菌（A.panax)中的一種或多種。本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3和SZ-81對(duì)人參 還具有促生長作用。 本發(fā)明還涉及微生物制劑，含有甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和甲基 營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3孢子，其可通過以下制備方法制備得到： (1) 將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3的試管種接種于用U)()0mL：￡角瓶裝的300mL NBP培 養(yǎng)液中，在180r/mi_n，30°C下培養(yǎng)36小捋，獲得發(fā)酵菌液； ⑵將發(fā)酵菌液在以種子罐體積10%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧 量為15~18%,攪拌速度200rpm，種子罐的溫度28~32°C,接種發(fā)酵菌液4小時(shí)后，每隔 2小時(shí)對(duì)種子罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè),直到發(fā)酵液菌體生長比較飽滿即將出現(xiàn)芽 ?包時(shí)!·獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時(shí)間為14~18小時(shí)； ⑶將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBP培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為 15~18% ,攪拌速度200j：pm，發(fā)酵罐的溫度28~32?,接種發(fā)酵菌種4小時(shí)后,每隔2小 時(shí)對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢