-3的試管種接種于用1000 mL :三角 瓶裝的300mL NBP培養(yǎng)液中，在ISOr/minjOX：下培養(yǎng)36小時,獲得發(fā)酵菌液； (2) 將發(fā)酵菌液在以種子罐體積10%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng),溶氧 董為15~18%，攪拌速度200:rpro，種子罐的溫度28~32*C，接種發(fā)酵菌敢4小時后，每隔 2小時對種子罐中的發(fā)酵液迸行發(fā)酵質(zhì)量檢測,直到發(fā)酵液菌體生長比較飽滿即將出現(xiàn)芽 孢時，獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時間為14~18小時； (3) 將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBP培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng),溶氧量為 15~18%,抱樣速度200_rpm,發(fā)酵罐的溫度28~32 C，接神發(fā)酵囷種4小時j-rj，每丨邊2小 時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察菌含量,直到發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物（包含 菌和芽孢）生物量為10scfu/mL以上、芽孢含量大于或等于95%時,立即將發(fā)酵液出罐，進 行分裝,獲得SZ-3微生物制劑；發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間為36~48小時。 優(yōu)選地，所述的NBP培養(yǎng)液的配方為：牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母浸膏5. 0g，葡萄糖5. 0g,NaC:[5. 0g，水丨000mL,p[:!6. 8~7. 2 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量百分比計為： 玉米松 2. 0 >〇 5 顯'講松 1 5 % ,癥粉 %,酵?'技胃 0? 2 %，NfiCi8, 0 % ,MgSO4 * /s：].2〇0. 10 少6， 余直為水，pH6, 8~/, 0。 更優(yōu)選地，所述的NBP培養(yǎng)液是這樣配制的：稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、 NaCl放入1000 mL水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6. 8~7. 2,丨OOOmL三角瓶中裝量為30〇EnL 培養(yǎng)液，用雙層封□膜封好:三角瓶口，mt:濕熱滅菌30分鐘,冷卻后備用； 優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液是這樣配制的：在種子罐中加入所需的水,按比例加入玉米 粉、豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO4 ? 7H20,充分攪拌,將發(fā)酵培養(yǎng)液pH調(diào)整到6。8~ 7. 0,密封加料孔，用1?;溫蒸汽滅菌2小時，冷卻后接種。 特別優(yōu)選地，在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵中，當出現(xiàn)較多泡沫時，加入消泡劑，所述的消 泡劑為有機娃,加入量以種子罐或發(fā)酵罐中的泡沫不溢出為準；發(fā)酵罐發(fā)酵完成后,在發(fā)酵 罐中加入占罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑,攪拌均勾，再出罐進行分裝。6. -種微生物制劑,其特征在于,含有權(quán)利要求2的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81的全培 養(yǎng)液培養(yǎng)物和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81的孢子。 7。 如權(quán)利要求6所述的微生物制劑，其特征在于，其是通過以_F制備方法制備得到的： (1) 將如權(quán)利要求2所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81的試管種接種于用1000 mL三角 瓶裝的300mL NBP培養(yǎng)液中，在180r/mim3(n〕下培養(yǎng)36小時,獲得發(fā)酵菌液； (2) 將發(fā)酵菌液在以種子罐體積10%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧 量為15~18%,攪拌速度200rpm,種子罐的溫度28~32T：，接種發(fā)酵菌液4小時后,每隔 2小時對科子罐中的發(fā)酵液進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，直到發(fā)酵液菌體生長比較飽滿即將出現(xiàn)芽 孢時，獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時間為14~18小時； (3)將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBP培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為 15~18%，攪拌速度200rpm,發(fā)酵罐的溫度28~32°C,接種發(fā)酵菌種4小時后,每隔2小 時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察菌含量，直到發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物（包含 菌和芽孢）生物量為IC^cfu/mL以上、芽孢貨量大于或等于95%時,立即將發(fā)酵液出罐，進 打分裝，獲得SZ_81微生物制劑;發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間為36~48小時。 優(yōu)選地5所述的NBP培養(yǎng)液的配方為：牛肉膏3,Og,蛋白胨10。Og,酵母浸膏5。Og,葡萄 糖5, 0g,NaC15,Og,水1000 mL,pH6. 8~7. 2 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量H分比計為： 玉米粉 2. 0%,豆餅粉i.5%,淀粉 0, 5%,酵母浸膏 0? 2%，Na,C18. 0%,MgSO4*7H200. 10%, 余量為水KP丨-丨6, 8~L0。 更優(yōu)選地,所述的NBP培養(yǎng)液是這樣配制的：稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、NaCl放入1000 mL水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6, 8~7. 2,1000 mL三角瓶中裝量為300mL 培養(yǎng)液，用雙展封口膜封好三角瓶口，121/C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用。 優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液是這樣配制的：在種子罐中加入所需的水,按比例加入玉米 粉、豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、NaCl、MgSO4 * 7H20,充分攪拌;將發(fā)酵培養(yǎng)液pH調(diào)整到6. 8~ 7. 0,密封加料孔,用高溫蒸汽滅菌2小齡，冷卻后立即接種。 特別優(yōu)選地,在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵過程中，當出現(xiàn)較多泡沫時，加入消泡劑,所述 的消泡劑為有機硅，加入量以種子罐或發(fā)酵罐中的泡沫不溢出為準；發(fā)酵罐發(fā)酵完成后,在 發(fā)酵罐中加入占罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進行分裝。8. -種微生物制劑,其特征在于，含有甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3和SZ-_8〗_的全培養(yǎng)液 培養(yǎng)物和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3和SZ-81的孢子。 優(yōu)選地,所述生物制劑是通過以下制備方法制備得到的：將如權(quán)利要求4或5中任一項 所述的微生物制劑和如權(quán)利要求6或7中任一項所述的微生物制劑混合，二者的體積比為 各占總體積的50%。或者，所述生物制劑是通過以卜制備力法制備得到的： (1) 將如權(quán)利要求1所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3的試管種和如權(quán)利要求2所述的 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81的試管種分別接種于用1000 mL :三角瓶裝的300mL NBP培養(yǎng)液 中，在180r/min,3(rC下培養(yǎng)36小射，獲得發(fā)酵菌液； (2) 將SZ-3發(fā)酵菌液和SZ-81發(fā)酵菌液以各占總體積的50%混合均勻后，在以種 子罐體積10%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為15~丨8%,攪拌速度 200rpm，種子罐的溫度28~32°C，接種發(fā)酵菌液4小時后,每隔2小捋對種子罐中的發(fā)酵液 進行發(fā)酵質(zhì)量檢測,直到發(fā)酵液菌體生長比較飽滿即將出現(xiàn)芽孢時,獲得發(fā)酵菌種，種子罐 中的發(fā)酵時間為14~18小時； (3) 將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBP培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為 15~18%，攪拌速度200rpm,發(fā)酵罐的溫度28~32°C,接種發(fā)酵菌種4小時后,每隔2小 時對發(fā)酵罐進行發(fā)酵質(zhì)量檢測，觀察菌含量，直到發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物（包含 菌和芽孢）生物量為IC^cfu/mL以上、芽孢貨量大于或等于95%時,立即將發(fā)酵液出罐，進 行分裝,獲得SZ--3和SZ-81微生物制劑；發(fā)酵罐中的發(fā)酵時間為36~48小時。 優(yōu)選地5所述的NBP培養(yǎng)液的配方為：牛肉膏3, Og,蛋白胨10。Og,酵母浸膏5。Og,葡萄 糖5, 0g, NaC15, Og,水1000 mL, pH6. 8~7. 2 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量H分比計為： 玉米粉 2. 0%,豆餅粉 i. 5%,淀粉 0, 5%,酵母浸膏 0? 2%，Na,C18. 0%, MgSO4 * 7H200. 10%, 余量為水KP丨-丨6,8~L0。 更優(yōu)選地,所述的NBP培養(yǎng)液是這樣配制的：稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、蔔萄糖、 NaCl放入1000 mL水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6, 8~7. 2, 1000 mL三角瓶中裝量為300mL 培養(yǎng)液，用雙展封口膜封好三角瓶口，121/C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用； 還更優(yōu)選地,所述的發(fā)酵培養(yǎng)液是這樣K制的：在種子罐中加入所需的水，按比例加 入玉米粉、豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、NaC:U MgSO4 * 7H20,充分攪拌,將發(fā)酵培養(yǎng)液pH調(diào)整到 6. 8~7. 0,密封加料孔,用高溫蒸汽滅菌2小時,冷卻后立即接種。 特別優(yōu)選地，在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵過程中，當出現(xiàn)較多泡沫時，加入消泡劑，所述 的消泡劑為舍機娃，加人重以種子罐或發(fā)酵罐中的泡沫不溢出為準；發(fā)酵罐發(fā)酵完成淚，在 發(fā)酵罐中加入占罐中液體總體積萬分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進行分裝。9. 如權(quán)利要求4-7中任一項所述的微生物制劑在防治人參真菌病害中的應(yīng)用。 優(yōu)選地，所述真菌為腐皮鐮孢菌（Fusa+rium. solani)、人參鏈格孢菌（Alternaria panax)和人參核盤菌（Sclerotirda schinseng)中的一?種或多種。 優(yōu)選地5其特征在于，所述真菌為毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon. destructans)、惡疫霉 菌（Phytophthora cactorum)和人參鏈格孢菌（Alternaria panax)中的一種或多種。 還優(yōu)選地,在人參真菌病害發(fā)病初期,將所述微生物制劑的稀釋液均勻地施加到土壤 中，所述的稀釋液中微生物制劑與水的稀釋體積比為1:200。 更優(yōu)選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機娃,所述助劑有機硅與稀釋液的體積比 為 i:5000。10.如權(quán)利要求8所述的微生物制劑在防治人參=具H'柄害中的應(yīng)用。 優(yōu)選地，所述真菌為腐皮鐮孢菌（Fusariura. solani)、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon. destructans)、惡疫霉菌（Phytophthora cactorum)、人參鏈格抱菌（Alternaria pa.nax)和 人參核盤菌（Sclerotinia schinseng)中的一種或多種。 還優(yōu)選地,在人參真菌病害發(fā)病初期,將所述微生物制劑的稀釋液均勻地施加到土壤 中，所述的稀釋液中微生物制劑與水的稀釋體積比為1:200。 更優(yōu)選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機娃,所述助劑有機硅與稀釋液的體積比 為 i:5000。
【專利摘要】本發(fā)明提供甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus？methylotrophicus)SZ-3和SZ81，其保藏號分別為CGMCC？No.8275和CGMCC？No.8276。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3對引起人參根腐病，黑斑病和菌核病的病原菌均具有顯著拮抗作用。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-81對引起人參疫病、銹腐病和黑斑病的病原菌均具有顯著拮抗作用。本發(fā)明還提供甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SZ-3和SZ81在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。<pb pnum="1" />CGMCC No827620130925
【IPC分類】A01N63/02, A01P3/00, A01N63/00, C12N1/20, C12R1/07
【公開號】CN105018366
【申請?zhí)枴緾N201410163871
【發(fā)明人】楊利民, 孫卓, 韓梅, 張永剛, 劉翠晶
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年4月22日