豬偽狂犬病病毒基因缺失株、疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒基因缺失株、及其制備的疫苗組合物，以及制備 方法和應(yīng)用，屬于動物病毒學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae) α亞科中的豬 皰瘆病毒I型（Suid herpesviruslstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動 物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴(yán)重，是制約規(guī)模化豬場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當(dāng)潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0003] 現(xiàn)在技術(shù)普遍使用gE缺失的偽狂犬弱毒疫苗防治豬偽狂犬病，使用采用自然缺 失或者人工缺失某些毒性基因的毒株來預(yù)防豬偽狂犬病，例如BUK株是Bucharest株經(jīng)過 雞胚和雞胚成纖維細胞800次傳代獲得的弱毒疫苗株，其缺失了大部分gE基因。還有人工 缺失的偽狂犬SA215毒株HB-98株等用于預(yù)防豬偽狂犬病。
[0004] 最近的研究報道稱豬偽狂犬病發(fā)生了新的特點，突出表現(xiàn)為任何年齡的豬都會感 染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病豬死亡率 在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達100%)，感染后可引起豬只高熱（40~42°C， 持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側(cè) 臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀?，F(xiàn)有技 術(shù)的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊，依然會出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢 絕等癥狀，感染率超過80%，發(fā)病率超過30%，死亡率在10%~20%之間。例如彭金美 等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013， 35(1) :1-4;童武等.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.中國動物傳染病學(xué) 報，2013,21(3) :1-7 ;Yu et al. , Pathogenic Pseudorabies Virus,China, 2012. Emerging infectious Diseases. 2014, 20(I):102-104 ；An et al. , Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, Emerging infectious Diseases. 2013. 19(11)： 1749-1755)，現(xiàn)有技術(shù)還沒有疫苗能夠解決針對豬偽狂犬變異株引起的偽狂犬病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種活的減毒豬偽狂犬病毒株，用于防治 變異偽狂犬病毒引起的豬狂犬病。其中，所述豬偽狂犬病病毒株缺失UL21基因。優(yōu)選地， 所述偽狂犬病毒株為偽狂犬變異株。
[0006] 作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明提供一種缺失UL21基因的偽狂犬病毒基因 工程弱毒株。
[0007] 優(yōu)選地，所述偽狂犬變異株為gE蛋白序列為SEQ ID N0.0 7或與其序列同源性為 95%以上的的毒株；更優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬變異株為經(jīng)分離的所述豬偽狂犬病毒變異 株當(dāng)重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株感染時，免疫了現(xiàn)有技術(shù)中基因缺失偽狂犬弱毒疫苗后 依然會造成豬出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕癥狀的毒株；最優(yōu)選地，所述的豬偽狂 犬變異株為當(dāng)重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株感染時，免疫了現(xiàn)有技術(shù)中缺失gE、TK和gl基 因中的一個及一個以上基因的偽狂犬弱毒疫苗后依然感染豬偽狂犬病并具備具有使9-10 日齡仔豬精神沉郁和食欲下降的毒株。
[0008] 術(shù)語"豬偽狂犬變異株"也稱為高致病性豬偽狂犬毒株，是指：表現(xiàn)為任何年齡的 豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病 豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達100% )，感染后可引起豬只高熱（40~ 42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀。優(yōu)選地，所 述的偽狂犬變異株為經(jīng)分離的所述豬偽狂犬病毒變異株當(dāng)重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株 感染時，免疫了現(xiàn)有技術(shù)中基因缺失偽狂犬弱毒疫苗后依然會造成豬出現(xiàn)高熱，精神沉郁， 食欲下降或廢絕等癥狀的毒株，優(yōu)選地所述偽狂犬變異株為gE蛋白序列為SEQ ID N0.0 7 或與其序列同源性為95%以上的蛋白序列的毒株。更優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬變異株為當(dāng) 重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株感染時，免疫了現(xiàn)有技術(shù)中缺失gE、TK和gl基因中的一個及 一個以上基因的偽狂犬弱毒疫苗后依然感染豬偽狂犬病并具備具有使9-10日齡仔豬精神 沉郁和食欲下降的毒株。
[0009] 最優(yōu)選的是偽狂犬變異株包括但不限于豬偽狂犬病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)(保藏號為CCTCC NO. V201311 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日），JS-2012株（童武， 張青占，鄭浩等，免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定[J].中國動物傳染病學(xué)報 2013, 21 (3) : 1-7);豬偽狂犬HeNl株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心,其菌種保藏編號為CGMCCN0. 6656,公開于專利申請CN102994458A ;NVDC-PRV-BJ株、 NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株（Xiuling Yu，Zhi Zhou，Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectious Diseases, www.cdc.gov/eid ol. 2〇, No. 1，January2〇14。豬偽狂犬病毒HNl2〇2株（Pseudorabies virus, strain HNl2〇2) (保藏號為CCTCC NO. V201335 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武 漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26日）。
[0010] 本發(fā)明術(shù)語"同源性"在本申請中是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?算得到，例如，可以將目標(biāo)氨基酸（或核苷酸）序列與參比氨基酸（或核苷酸）序列進行 序列比對，必要時可以引入空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸（或核苷酸）數(shù)目 達到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計算兩條氨基酸（或核苷酸）序列之間相同氨基酸（或核苷 酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比對和同源性的計算可以通過本領(lǐng)域公知的 軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件（在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI)的網(wǎng)址上 可獲得：http://blast, nebi. nlm. nih. gov/Blast. cgi，或者見，例如，Altschul S. F. et al, J. Mol. Biol. , 215 :403-410 (1990) ；Stephen F. et al, Nucleic Acids Res. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2軟件（在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得：http://www. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/,另見，例如，Higgins D. G. et al,Methods in Enzymology, 266:383-402(1996) ；Larkin M. A. et al, Bioinformatics(Oxford, England),23(21)： 2947-8(2007));和TCoffee軟件等（在瑞典生物信息學(xué)研究所的網(wǎng)站上可以獲得： http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index. cgi,另見，例如， Poirot 0. et al,Nucleic Acids Res. ,31(13) :3503-6(2003) ；Notredame C. et al,J.Mol. Boil. ,302(1) :205-17(2000))。使用軟件進行序列比對時，可以使用軟件提供的默認參數(shù)， 或者也可以根據(jù)實際情況對軟件提供的參數(shù)進行調(diào)整，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范 圍內(nèi)。
[0011] NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株公開于 Xiuling Yu, Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectiou s Diseases, www. cdc. gov/eid ol. 20, No. 1，January2014〇
[0012] 豬偽狂犬病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus, strain HN1202)保藏號為 CCTCC NO. V201335 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏日期 為2013年8月26日。
[0013] 優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病毒弱毒株進一步缺失TK、gE、gl基因中的一個或多個。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明提供一種缺失gE、TK、gI、UL21基因的偽 狂犬病毒基因工程弱毒株。
[0015] 優(yōu)選地，所述一種缺失gE、TK、gl和UL21基因的偽狂犬病毒基因工程弱毒株為豬 偽狂犬HN1201株的缺失gE、TK和gl和UL21基因的基因工程弱毒株。
[0016] 優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病毒弱毒株基因組中TK基因位置核苷酸序列編碼SEQ. NO. 4的氨基酸序列；所述的豬偽狂犬病毒弱毒株基因組中g(shù)E和gl基因位置核苷酸序列為 SEQ. NO. 6的核苷酸序列。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒弱毒株，其中， 所述的豬偽狂犬病毒弱毒株包括不能表達UL21、TK、gE、gl蛋白的HN1201株、HN1202株、 JS-2012 株、豬偽狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株。
[0018] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述偽狂犬病毒弱毒株為利用基因工程缺失 UL21基因的豬偽狂犬病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)其中所述的豬 偽狂犬HN1201株保藏號為CCTCC N0.V201311 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址 為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日。
[0019] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述所述偽狂犬病毒弱毒株為利用基因工程手 段缺失gE、TK、gl的豬偽狂犬HN1201株。
[0020] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述偽狂犬病毒弱毒株為利用基因工程手段缺 失gE、TK、gI和UL21基因的豬偽狂犬HN1201株。
[0021] 本發(fā)明所用術(shù)語"減毒"是指：經(jīng)基因缺失的豬偽狂犬病毒與未經(jīng)修飾的親本株相 比毒力降低。表現(xiàn)在豬死亡頭數(shù)、發(fā)燒頭數(shù)的減少和和發(fā)燒維持時間的變短。如果病毒株 的一種或多種確定疾病嚴(yán)重性的參數(shù)在統(tǒng)計學(xué)的差異顯著性降低，則其"毒力更小"。
[0022] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物含有免疫量的 所述的基因缺失毒株。
[0023] 發(fā)明的再一個目的是提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的 所述的豬偽狂犬病毒弱毒株抗原和載體。
[0024] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述疫苗組合物包括免疫量的所述缺失UL21基因 的豬偽狂犬病病毒株變異株的減毒活疫苗和載體。
[0025] 作為本發(fā)明的另一種實施方式，所述疫苗組合物包括免疫量的所述缺失gE、TK、gI 基因的豬偽狂犬病病毒株變異株的減毒活疫苗和載體