比稀釋接種到預先鋪好的Vero細胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進行 純化，經(jīng)過8輪的噬斑純化，得到純化的不含野生型病毒HN1201的UL21缺失的重組病毒 rPRV-GFP-UL21 。
[0245] 3. 3UL21缺失重組病毒中GFP標記基因的刪除
[0246] 將表達Cre酶的pBS185質(zhì)粒（購買自addgene，Cre酶識別同源臂UL21A下游和 UL21B上游的IoxP位點，將兩個Ioxp位點中間的序列刪除）和重組病毒rPRV-GFP-UL21基 因組DNA共轉(zhuǎn)染vero細胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)比較明顯的病變，而且單個熒光比較多。收 獲的PO代病毒倍比稀釋后接種進行空斑篩選，挑取沒有熒光的噬斑進行下一輪純化。經(jīng)過 2輪篩選純化，得到?jīng)]有熒光的病毒，命名為VPRV-UL21。提取純化病毒基因組DNA，PCR鑒 定表明UL21基因缺失，且GFP標記基因也已經(jīng)刪除。說明不含GFP標記基因的UL21缺失病 毒純化成功。將缺失TK/gE/gI/UL21基因的病毒株命名為PRV HN1201TK/gE/gI/UL21株。
[0247] 實施例4、偽狂犬病毒基因缺失株的致病性試驗
[0248] 9日齡的豬偽狂犬抗原抗體陰性仔豬25頭隨機分成5組（A、B、C、D和空白對照 組），每組5頭，分組和攻毒情況見表1。
[0249] 表1、致病性試驗動物分組
[0251] 病毒接種后，每日測定仔豬體溫，觀察臨床癥狀和死亡情況，具體結(jié)果見表2。
[0252] 表2不同豬偽狂犬基因缺失株對9日齡仔豬的致病性
[0253]

[0255]
[0256] 結(jié)果顯示，豬偽狂犬病病毒HN1201株可以導致9日齡仔豬100%死亡（5/5)而缺 失 UL21 基因的 PRV HN1201UL21 株和缺失 TK/gE/gl 的 PRV HN1201TK/gE/gI/株，都可以 造成病毒的毒性降低，但仍有殘留毒力，會造成發(fā)熱等臨床癥狀，而缺失TK/gE/gI/UL21基 因的PRVHN1201株TK /gE /gl /UL21已完全沒有毒性。
[0257] 實施例5、豬偽狂犬病病毒基因缺失活疫苗的制備
[0258] 5. 1、疫苗病毒的增殖
[0259] 將實施例1制備的RV HN1201UL21株、實施例2制備的PRVHN1201TK /gE /gl株 和實施例3制備的PRV HN1201TK /gE /gl /UL21株的毒種5X IO4倍稀釋后接種已長成單 層的ST細胞，吸附Ih后，加入1000 ml含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37°C溫室中轉(zhuǎn)瓶 培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為6轉(zhuǎn)/小時。待80%細胞病變后，反復凍融2次，收獲病毒，測定病毒滴度。病 毒液置低溫保存。
[0260] 5. 2、保護劑的配制每100mL去離子水中加蔗糖40g，明膠8g，充分融化后，置高壓 蒸氣滅菌（121°C 30min)。
[0261] 5. 3、疫苗病毒混懸液的配比
[0262] 將5. 1中制備并保存的病毒液與5. 2中制備的保護劑保護劑按1:1 (體積比）混 合，分裝至滅菌的青瓶中，每瓶裝量2. 6ml。凍干。檢驗疫苗無細菌及外源病毒污染，與凍干 前病毒含量基本一致。將實施例1制備的RV HN1201UL21株批號為20140101，實施例2制 備的 PRV HN1201TK /gE /gl 株批號為 20140202,實施例 3 制備的 PRV HN1201TK /gE /gl / UL21 株批號為 20140303。
[0263] 實施例6、豬偽狂犬病病毒基因缺失活疫苗的免疫原性實驗
[0264] 將9日齡的PRV抗原抗體陰性仔豬25頭隨機分成5組，5頭/組，按照表3接種 實施例5制備的疫苗，對照疫苗采用西班牙海博萊生物大藥廠的豬偽狂犬活疫苗（Bartha K-61株）批號為42RH，按照說明書用量使用，對照組接種DMEM培養(yǎng)基Iml/頭。免疫后28 日后攻毒，攻毒劑量為HN1201株豬偽狂犬病病毒IX l(f°TCID5。/頭，攻毒后每日測定仔豬 體溫，觀察臨床癥狀和死亡情況（結(jié)果見表3)，攻毒前分別對試驗組和對照組仔豬采血。
[0265] 表3免疫原性試驗動物分組
[0266]
[0267] 疫苗免疫后，每周參照GB/T18641-2002方法中血清中和試驗的方法測定中和抗 體效價，結(jié)果見表4。
[0268] 表4豬偽狂犬基因缺失活疫苗免疫仔豬后不同時間的抗體情況
[0270] 表4的結(jié)果顯示，豬偽狂犬基因缺失活疫苗免疫仔豬后，能產(chǎn)生較高的中和抗體， 且隨免疫時間逐漸升高。
[0271] 免疫后28日后攻毒，攻毒劑量為豬偽狂犬病毒HN1201株lXl(f°TCID5。/頭，Iml/ 頭，觀察臨床癥狀和死亡情況見表5,攻毒后每日測定仔豬體溫并觀察臨床癥狀。
[0272] 表5豬偽狂犬活疫苗免疫仔豬后的攻毒情況及臨床情況
[0274] 表4和表5的結(jié)果顯示，豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫仔豬后，可以阻斷病毒感染 (出現(xiàn)臨床癥狀），能為仔豬提供100% (5/5)保護，而對照仔豬攻毒后5日后全部死亡，因 此，豬偽狂犬活疫苗具有很好的保護力。而III組效果相對于對照組活疫苗，以及I組和 II組，完全沒有臨床癥狀，顯示出很好的免疫保護和安全性。
[0275] 實施例 7NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD、HN1202 株偽狂犬病毒 變異株的基因缺失株的構(gòu)建
[0276] 分別以 NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株（Xiuling Yu, Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfecti ous Diseases，www. cdc. gov/eid ol. 20, No. 1，January2014)(申請人承諾按照專利審查 指南規(guī)定，自專利申請日起向公眾發(fā)放20年），HN1202株（藏號為CCTCC N0.V201335); 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏日期為2013年 8月26日）為親本毒株，參照實施例2、3的方法缺失TK/gE/gl以及UL21基因，制備的弱 毒株名稱分別為 NVDC-PRV-BJ TK/gE/gl/UL21 株，NVDCPRV-HEB TK/gE/gl/UL21 株、 NVDC-PRV-SDTK /gE /gl /UL21 株，和 PRVHN1202TK /gE /gl /UL21 株，經(jīng) PCR 跟親本毒株對 比證明基因缺失。
[0277] 實施例 8NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD、HN1202 株偽狂犬病毒 變異株弱毒株疫苗組合物的制備
[0278] 按照實施例5. 1方法增殖實施例7制備的各弱毒疫苗株，按照體積比1:1比例 加入保護劑（每100mL去離子水中加蔗糖40g，明膠8g，充分融化后，置高壓蒸氣滅菌 (121°C 30min)后凍干，NVDC-PRV-BJTK /gE /gl /UL21 株批號為 Q01，NVDCPRV-HEB TK /gE / gl /UL21 株批號為 Q02, NVDC-PRV-SDTK /gE /gl /UL21 株批號為 Q03, PRVHN1202TK /gE / gl /UL21株批號為Q04。
[0279] 實施例9、實施例7制備毒株的致病性試驗
[0280] 按照實施例6的方法進行毒性試驗，實驗豬共分為5組，每組5頭，分別滴鼻接種 實施例 7 制備的 NVDC-PRV-BJ TK /gE /gl /UL21 株，NVDCPRV-HEB TK /gE /gl /UL21 株、 NVDC-PRV-SDTK /gE /gl /UL21 株，和 PRVHN1202TK /gE /gl /UL21 株的進行試驗各組均滴 鼻接種lml(l(f°TCID5(]/ml)，，結(jié)果顯示各組豬均存活，體溫正常，無臨床癥狀。證明通過缺 失TK/gE/gI/UL21基因減低了變異偽狂犬毒株的毒性。
[0281] 實施例10、實施例8制備疫苗的免疫原性試驗
[0282] 按照實施例6的試驗方法以及接種量對實施例8制備的疫苗進行免疫原性試驗， 同時接種對照疫苗豬偽狂犬活疫苗HB-98株批號1308011-1 (中牧實業(yè)股份有限公司成都 藥械廠），免疫后28日后攻毒，攻毒劑量為豬偽狂犬病病毒HN1201株I X 1(^°TCID5。/頭，觀 察臨床癥狀和死亡情況，攻毒后每日測定仔豬體溫并觀察臨床癥狀，結(jié)果見表6。
[0283] 表6豬偽狂犬活疫苗免疫仔豬后的攻毒情況及臨床情況
[0284]
[0285] 表6的結(jié)果顯示，豬偽狂犬疫苗免疫仔豬后，可以阻斷病毒感染（出現(xiàn)臨床癥狀）， 能為仔豬提供100% (5/5)保護，疫苗對照組僅能提供80 % (4/5)的保護，而對照仔豬攻毒 后3日后全部死亡，因此，豬偽狂犬活疫苗具有很好的保護力。另外相對于現(xiàn)有技術(shù)的活疫 苗，基本沒有臨床癥狀，顯示出很好的免疫保護
[0286] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，所述豬偽狂犬病毒弱毒株為缺失UL21基因的豬偽 狂犬病毒株，優(yōu)選地，所述偽狂犬病毒株為偽狂犬變異株。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，所述偽狂犬變異株為gE蛋白序 列為SEQ ID N0.0 7或與其序列同源性為95%以上的的毒株；優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬變異 株為經(jīng)分離的所述豬偽狂犬病毒變異株當重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株感染時，免疫了現(xiàn) 有技術(shù)中基因缺失偽狂犬弱毒疫苗后依然會造成豬出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕 癥狀的毒株；更優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬變異株為當重現(xiàn)所述豬偽狂犬病毒變異株感染時， 免疫了現(xiàn)有技術(shù)中缺失gE、TK和gl基因中的一個及一個以上基因的偽狂犬弱毒疫苗后依 然感染豬偽狂犬病并具備具有使9-10日齡仔豬精神沉郁和食欲下降的毒株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1~2任一項所述的豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，所述豬偽狂犬病毒弱 毒株基因組中整個UL21蛋白的ORF缺失。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，所述的豬偽狂犬病毒弱毒株進 一步缺失TK、gE、gl基因中的一個或多個。5. -種豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，所述的豬偽狂犬病毒弱毒株包括缺失UL21、TK、 gE、gl 基因的 HN1201 株、HN1202 株、JS-2012 株、豬偽狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、 NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株。6. -種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的權(quán)利要求1~5任一項所述的 豬偽狂犬病毒弱毒株抗原和載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其中，所述豬偽狂犬病毒弱毒株抗原為活的豬 偽狂犬病毒弱毒株；所述疫苗組合物進一步包括凍干保護劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在所述疫苗進一步含有失活病原體或抗 原組合，優(yōu)選地所述抗原為豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒和/或副豬嗜 血桿菌或支原體。9. 權(quán)利要求6~7任一項所述的疫苗組合物在制備預防和治療豬偽狂犬病的藥物中的 應用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其中，所述的豬偽狂犬病是由權(quán)利要求3所述的豬偽 狂犬病毒株變異株導致的豬偽狂犬病。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病毒弱毒株，其中，該豬偽狂犬病毒弱毒株為缺失UL21基因的豬偽狂犬病毒變異株。本發(fā)明還提供了包含該豬偽狂犬病毒弱毒株抗原的疫苗組合物，及其制備方法和應用。經(jīng)活疫苗免疫原性實驗和致病性免疫原性試驗證明，該豬偽狂犬活疫苗具有很好的保護力，基本沒有臨床癥狀，顯示出很好的免疫保護。CCTCC No：V20131120130520
【IPC分類】C12N7/04, A61K39/295, A61K39/245, A61P31/22, C12R1/93
【公開號】CN105018436
【申請?zhí)枴緾N201410174926
【發(fā)明人】張許科, 孫進忠, 譚菲菲, 肖燕, 田克恭
【申請人】普萊柯生物工程股份有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年4月28日