GTCGTGGGCATCGTCATC (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0169] gEIAR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat
[0170] TACGGACCGGGCTGCGCTTT (下劃線為Xba I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Loxp位點(diǎn)）
[0171] 右側(cè)同源臂gEIB的上下游引物分別為：
[0172] gEIBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatCCCGCCCCGCTTAAATACC G (下劃線為Sph I酶切位點(diǎn)）
[0173] gEIBR:CCCAAGCTTCCAGGAGCACCTGGTCGCAGA(下劃線為 Hind III 酶切位點(diǎn)）
[0174] 取PRV HN1201-TK病毒感染vero細(xì)胞，待細(xì)胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上 清，采用Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源 臂擴(kuò)增的模板。
[0175] 2. I. L 2同源臂gEIA、gEIB的擴(kuò)增及克隆
[0176] 利用TAKARA的PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增gEIA、gEIB，體系及條件如下：
[0179] PCR擴(kuò)增出的gEIA和gEIB片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑 盒回收目的片段。將gEIA片段和pUC19載體分別用EcoR I和XbaI雙酶切后，回收目的片 段，T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定正 確后，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCgEIA。將pUCgEIA和gEIB分別用SphI和HindIII雙酶切 后回收目的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克 隆提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUCgEIAB。
[0180] 2. 1. 2標(biāo)記基因 GFP的擴(kuò)增
[0181] 2. I. 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點(diǎn)的去除
[0182] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒（購自Clontech，貨號632470)用Bgl II和SmaI雙酶切后，回 收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補(bǔ)平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0183] 2. I. 2. 2GFP 基因的擴(kuò)增
[0184] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設(shè)計擴(kuò)增GFP的引物：
[0185] 上游引物
[0186] CMVU: ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG (下劃線為 Sal I 酶切位點(diǎn)）
[0187] 下游引物
[0188] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點(diǎn)）
[0189] 以質(zhì)粒pAcGFP Λ MCS為模板擴(kuò)增GFP基因，體系及條件如下：
[0190]
[0192] 電泳回收目的條帶進(jìn)行下一步的連接。
[0193] 2. L 3GFP標(biāo)記基因與pUCgEIAB的連接
[0194] 將GFP用Sail和SphI雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pUCgEIAB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCgEIA-GFP-B。
[0195] 2. 2含有GFP的重組病毒的獲得
[0196] 2. 2. 1轉(zhuǎn)移載體pUCgEIA-GFP-B和vPRV-TK DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得重組病毒
[0197] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，將3 μ g PRV-TK病毒基因組DNA和5 μ g轉(zhuǎn)移載體 pUCgEIA-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號 11668030)說明書上的步驟進(jìn) 行轉(zhuǎn)染。在37°C含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細(xì)胞病變，且病變處有 熒光后，收獲細(xì)胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-TK gE gl。
[0198] 2. 2. 2重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl的噬斑純化
[0199] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl感染Vero細(xì)胞后，鋪上2%的低熔點(diǎn) 瓊脂糖，48h后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融3 次后，10倍倍比稀釋接種到預(yù)先鋪好的Vero細(xì)胞六孔板中，繼續(xù)挑取綠色熒光噬斑進(jìn)行純 化，經(jīng)過10輪的噬斑純化，得到純化的不含PRV-TK病毒的重組病毒rPRV-GFP-TK gE gl。
[0200] 2. 3TK/gE/gI缺失重組病毒中GFP標(biāo)記基因的刪除
[0201] 將表達(dá)Cre酶的pBS185質(zhì)粒（購買自addgene，Cre酶識別同源臂gEIA 下游和gEIB上游的IoxP位點(diǎn)，將兩個Ioxp位點(diǎn)中間的序列刪除）和重組病毒 rPRV-GFP-TK gE gl基因組DNA共轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)比較明顯的病變，而 且單個熒光比較多。收獲的PO代病毒倍比稀釋后接種進(jìn)行空斑篩選，挑取沒有熒光的噬斑 進(jìn)行下一輪純化。經(jīng)過2輪篩選純化，得到?jīng)]有突光的病毒，命名為vPRV-TKgEgl。提取 純化病毒基因組DNA，PCR鑒定表明TK、gE、gl基因均已經(jīng)缺失，且GFP標(biāo)記基因也已經(jīng)刪 除。說明不含GFP標(biāo)記基因的TK/gE/gl缺失病毒純化成功。將缺失TK/gE/gl基因的病毒 株命名為 PRV HN1201TK/gE/gI 株。
[0202] 2. 4PRV HN1201TK/gE/gl 毒株缺失基因鑒定
[0203] 提取TK/gE/gl缺失病毒和野生型病毒的病毒基因組，進(jìn)行PCR鑒定，TK缺失鑒定 引物同實施例2中的I. 4 ;gE/gI基因缺失鑒定引物如下：
[0204] gEICF:tgcgtctacatcttcttccgcctgag
[0205] gEICR:caagtccgagtccgtgcccaca
[0206] 野生型病毒擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為3531bp，TK/gE/gl缺失病毒擴(kuò)增的PCR片段大 小為592bp，見圖7。
[0207] 實施例 3PRV HN1201TK-/gE-/gI-/UL21-缺失毒株的制備
[0208] 3. IPRV HN1201缺失UL21所需的GFP中間轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0209] 用實施例2制備PRV HN1201TK/gE/gI株。根據(jù)要缺失的UL21基因的序列， 在其兩端設(shè)計同源臂，分別為UL21A和UL21B。將UL21A和UL21B克隆到pUC19載體上， 命名為PU⑶L21AB。然后將GFP基因克隆至pU⑶L21AB上，獲得重組病毒轉(zhuǎn)移載體，命名 PU⑶L21A-GFP-B。轉(zhuǎn)移載體中同源臂為UL21兩側(cè)序列，所以重組后得到的重組病毒即為 UL21基因缺失的。重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖見圖1，圖2為UL21A和UL21B同源臂在基因 組上所在位置。
[0210] 3. 1. 1、同源重組臂的擴(kuò)增及克隆
[0211] 3. I. I. 1引物設(shè)計和模板制備
[0212] 根據(jù)HN1201病毒的基因序列設(shè)計兩對引物，用于擴(kuò)增UL21基因兩側(cè)的同源臂：
[0213] 左側(cè)同源臂UL21A的上下游引物分別為：
[0214] UL21AF: CCGGAATTCTCTCCCACAGCCAGACTCCC (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)）
[0215] UL21AR:CTAGTCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatAACCAAACACCACGTCCG C (下劃線為Xba I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0216] 右側(cè)同源臂UL21B的上下游引物分別為：
[0217] UL21BF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatATGGCGGCGGGCACACGC GG (下劃線為Sph I酶切位點(diǎn)，小寫字母為Ioxp位點(diǎn)）
[0218] UL21BR:CCCAAGCTTGGCGTTGAGGGAGCGGCGAT(下劃線為 Hind III 酶切位點(diǎn)）
[0219] ??？1^圓1201感染代仰細(xì)胞，待細(xì)胞80%以上發(fā)生病變后，取部分上清，采用 UL21neaid Viral Nucleic Acid Extraction試劑盒提取病毒基因組DNA，作為同源臂擴(kuò)增 的模板。
[0220] 3. I. 1. 2同源臂UL21A、UL21B的擴(kuò)增及克隆
[0221] 利用TAKARA的PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增UL21A、UL21B，體系及條件如下：
[0222]
[0224] PCR擴(kuò)增出的UL21A和UL21B片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，用天根膠回收試劑 盒回收目的片段。將UL21A片段和pUC19載體分別用EcoR I和XbaI雙酶切后，回收目的 片段，T4DNA Iigase連接后轉(zhuǎn)化DH5a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆酶切鑒定 正確后，鑒定正確的質(zhì)粒命名為PUCUL21A。將pUCUL21A和UL21B分別用SphI和HindIII 雙酶切后回收目的片段，T4DNA Iigase連接后，轉(zhuǎn)化DH5 a，涂布氨芐板37°C培養(yǎng)過夜。挑 取單克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為PUCUL21AB。
[0225] 3. 1. 2標(biāo)記基因 GFP的擴(kuò)增
[0226] 3. L 2. IGFP載體pAcGFP-Cl多克隆位點(diǎn)的去除
[0227] 將pAcGFP-Cl質(zhì)粒（購自Clontech，貨號632470)用Bgl II和SmaI雙酶切后，回 收線性化的載體，經(jīng) DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment 補(bǔ)平，T4DNA Ligase 連接 后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a獲得刪除MCS的GFP質(zhì)粒，命名為：pAcGFPAMCS。
[0228] 3. I. 2. 2GFP 基因的擴(kuò)增
[0229] 根據(jù)pAcGFP-Cl載體序列設(shè)計擴(kuò)增GFP的引物：
[0230] 上游引物
[0231] CMVU: ACGCGTCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG (下劃線為 Sal I 酶切位點(diǎn)）
[0232] 下游引物
[0233] SV40R: ACATGCATGCCTAGAATGCAGTGAAAAAAATGC (下劃線為 Sph I 酶切位點(diǎn)）
[0234] 以質(zhì)粒pAcGFP Λ MCS為模板擴(kuò)增GFP基因，體系及條件如下：
[0235]
[0237] 電泳回收目的條帶進(jìn)行下一步的連接。
[0238] 3. I. 3GFP標(biāo)記基因與pUCUL21AB的連接
[0239] 將GFP用Sal I和Sph I雙酶切后，回收目的片段，和經(jīng)過同樣雙酶切的pTOUL21AB 質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名 為 pUCUL2IA-GFP-B。
[0240] 3. 2含有GFP的重組病毒的獲得
[0241] 3. 2. 1轉(zhuǎn)移載體和HN1201DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得重組病毒
[0242] 以脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，將3ug PRV-HN1201病毒基因組DNA和5ug轉(zhuǎn)移載 體 PUCUL21A-GFP-B，按照 Lipofectamine2000(Invitrogen，貨號 11668030)說明書上的步 驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在37°C含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后36-48h，待出現(xiàn)細(xì)胞病變，且病變 處有熒光后，收獲細(xì)胞上清，即為PO代重組病毒，命名為rPRV-GFP-UL21。
[0243] 3. 2. 2重組病毒的噬斑純化
[0244] 將獲得的PO代重組病毒rPRV-GFP_UL21感染Vero細(xì)胞后，鋪上2%的低熔點(diǎn) 瓊脂糖，48h后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變和熒光后，挑取帶有綠色熒光的噬斑于-70°C凍融3 次后，10倍倍