信使rna的純化方法
【專利說明】信使RNA的純化方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)案要求2013年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/784，996的權(quán)益，其整體通過弓I用并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]信使RNA療法正成為日益重要的治療各種疾病的方法。信使RNA療法涉及向需要該療法的患者施用信使RNA(mRNA)并在患者體內(nèi)生成由mRNA編碼的蛋白質(zhì)。因此，重要的是確保生成高純度且安全的mRNA產(chǎn)物。傳統(tǒng)上，RNA純化通常采用旋轉(zhuǎn)柱并且涉及使用腐蝕性或易燃性溶劑，例如乙醇，這對(duì)于治療劑施用和大規(guī)模生產(chǎn)而言不合需要。
[0005]發(fā)明概述
[0006]本文提供了基于切向流過濾(TFF)，純化適合作為藥物產(chǎn)品施用的mRNA的改進(jìn)方法。在本發(fā)明之前，RNA純化通常采用旋轉(zhuǎn)柱并且涉及使用腐蝕性或易燃性溶劑，例如乙醇，這對(duì)于治療劑施用和大規(guī)模生產(chǎn)而言不合需要。進(jìn)一步地，先前技術(shù)方法通常不允許分離稱為提前中斷產(chǎn)物或“短聚物(shortmer) ”的不完全轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，據(jù)報(bào)道這具高免疫刺激性并且其存在可大大改變mRNA作為活性藥物成分(API)的毒性和耐受性。本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)切向流過濾對(duì)從mRNA生成混合物中去除反應(yīng)物、酶、副產(chǎn)物，尤其是短聚物驚人地有效。如本文所述，切向流過濾，特別是與使用變性劑的預(yù)處理相結(jié)合，可有效地去除反應(yīng)物、酶和包括提前中斷RNA序列(即，短聚物)在內(nèi)的副產(chǎn)物，同時(shí)仍保持mRNA的完整性。更令人驚訝的是，本發(fā)明人已經(jīng)證明僅使用含水緩沖液作為溶劑，無需使用任何腐蝕性或易燃性溶劑，可成功地進(jìn)行切向流過濾。因此，本發(fā)明提供了一種更有效、可靠且更安全的從大規(guī)模生產(chǎn)工藝治療應(yīng)用中純化mRNA的方法。
[0007]—方面，本發(fā)明尤其提供了純化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括(a)使包含體外合成的mRNA的摻雜制劑經(jīng)受變性條件，以及(b)通過切向流過濾從來自于步驟(a)的所述摻雜制劑純化所述mRNA的步驟，其中從步驟(b)純化的所述mRNA基本上無提前中斷的RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。
[0008]在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括向摻雜制劑添加蛋白質(zhì)變性劑。在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括在室溫下用添加的蛋白質(zhì)變性劑孵育摻雜制劑約1-10分鐘(例如，約2-9、2-8、2-7、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6 分鐘)。在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括在室溫下用添加的蛋白質(zhì)變性劑孵育摻雜制劑約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘。在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括在室溫下用添加的蛋白質(zhì)變性劑孵育摻雜制劑約5分鐘。在一些實(shí)施方案中，適合的蛋白質(zhì)變性劑選自脲、硫氰酸胍、KCl、十二烷基硫酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、其它洗滌劑及其組合。
[0009]在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括向摻雜制劑中添加脲以達(dá)到約IM或更高的所得脲濃度。在一些實(shí)施方案中，所得脲濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高，7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。
[0010]在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括向摻雜制劑中添加硫氰酸胍以達(dá)到約IM或更高的所得硫氰酸胍濃度。在一些實(shí)施方案中，所得硫氰酸胍濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高、7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。
[0011]在一些實(shí)施方案中，步驟(a)包括向摻雜制劑中添加KCl以達(dá)到約IM或更高的所得KCl濃度。在一些實(shí)施方案中，所得KCl濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高，或5M或更高。
[0012]在一些實(shí)施方案中，僅使用水溶劑進(jìn)行切向流過濾。在一些實(shí)施方案中，使用水作為溶劑進(jìn)行切向流過濾。在一些實(shí)施方案中，以大約100-200mL/分鐘(例如，大約100-180mL/ 分鐘、100_160mL/ 分鐘、100_140mL/ 分鐘、110_190mL/ 分鐘、110_170mL/ 分鐘或110-150mL/分鐘)的給料速度和/或大約10_50mL/分鐘(例如，大約10_40mL/分鐘、10-30mL/分鐘、20-50mL/分鐘或20_40mL/分鐘)的流速進(jìn)行切向流過濾。在一些實(shí)施方案中，以大約 100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mL/ 分鐘的給料速度和 /或大約10、20、30、40或50mL/分鐘的流速進(jìn)行切向流過濾。
[0013]在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA含有少于約5% (例如，少于約4%、3%、2%或1%)的提前中斷RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA含有少于約1% (例如，少于約0.9%,0.8%,0.7%,0.6%,0.5%,0.4%、0.3%、0.2%或0.1% )的提前中斷RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA含有少于0.5%的提前中斷RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA含有少于0.1 %的提前中斷RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。在一些實(shí)施方案中，如通過溴化乙錠和/或考馬斯亮藍(lán)染色(Coomassie staining)測(cè)定，從步驟(b)純化的mRNA含有不可檢測(cè)的提前中斷RNA序列和/或用于體外合成的酶試劑。
[0014]在一些實(shí)施方案中，提前中斷RNA序列包含少于15個(gè)堿基(例如，少于14、13、12、11、10、9或8個(gè)堿基)。在一些實(shí)施方案中，提前中斷RNA序列包含約8_12個(gè)堿基。
[0015]在一些實(shí)施方案中，用于體外合成的所述酶試劑包含T7RNA聚合酶、DNA酶1、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，用于體外合成的所述酶試劑包含T7RNA聚合酶。
[0016]在一些實(shí)施方案中，切向流過濾在向體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸(poly_A)尾之前進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，切向流過濾在向所述體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，切向流過濾在向所述體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之前和之后進(jìn)行。
[0017]在一些實(shí)施方案中，體外合成的mRNA長(zhǎng)度大于約lkb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb。在一些實(shí)施方案中，體外合成的mRNA包含一個(gè)或多個(gè)修飾以增強(qiáng)穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)修飾選自經(jīng)修飾的核苷酸、經(jīng)修飾的糖磷酸骨架、5’和/或3’非翻譯區(qū)。在一些實(shí)施方案中，體外合成的mRNA未經(jīng)修飾。
[0018]在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA具有高于約95% (例如，高于約96%、97%、98%、99%或更高)的完整性。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA具有高于98%的完整性。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA具有高于99%的完整性。在一些實(shí)施方案中，從步驟(b)純化的mRNA具有高于大約100%的完整性。
[0019]本發(fā)明還提供了生產(chǎn)信使RNA(mRNA)的方法，包括體外合成mRNA，并且使用根據(jù)本文所述的方法純化體外合成的mRNA的步驟。
[0020]本發(fā)明還提供了根據(jù)本文所述的方法純化的信使RNA(mRNA)。
[0021]在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“約”和“大約”作為等效項(xiàng)使用。本申請(qǐng)中使用的任何數(shù)值，在有或無約/大約的情況下，意指涵蓋相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員理解的任何正常變動(dòng)。
[0022]在隨后的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見。然而，應(yīng)理解，詳細(xì)描述雖然表明本發(fā)明的實(shí)施方案，但僅以示例說明而非限制的方式提供?；谠敿?xì)描述，在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見。
[0023]附圖簡(jiǎn)述
[0024]以下圖僅是出于示例說明目的而非限制。
[0025]圖1顯示了如凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色所示，連同各種對(duì)照一起，根據(jù)提供的包括暴露于脲的方法純化的FFL mRNA樣品體外轉(zhuǎn)錄的示例性蛋白質(zhì)水平。
[0026]圖2顯示了如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所示，與根據(jù)傳統(tǒng)方法純化的mRNA相比，根據(jù)提供的方法純化的體外轉(zhuǎn)錄樣品的示例性螢火蟲熒光素酶(FFL)mRNA水平。
[0027]圖3顯示了與根據(jù)傳統(tǒng)方法凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色純化的mRNA相比，根據(jù)提供的包括暴露和不暴露于5M脲的TFF的方法純化的FFL mRNA樣品體外轉(zhuǎn)錄的示例性蛋白質(zhì)水平。
[0028]圖4描繪了與由傳統(tǒng)方法提供的純化mRNA相比，從由提供的方法提供的翻譯純化FFL mRNA收集的示例性熒光數(shù)據(jù)。
[0029]圖5顯示與根據(jù)傳統(tǒng)方法凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色純化的mRNA相比，來自于根據(jù)提供的包括暴露于蛋白酶K和/或5M脲的方法純化的因子IX(FIX)mRNA體外轉(zhuǎn)錄樣品的示例性蛋白質(zhì)水平。
[0030]圖6顯示了如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所示，根據(jù)提供的方法純化的體外轉(zhuǎn)錄樣品中的示例性FIX mRNA水平。
[0031]圖7顯示了與根據(jù)傳統(tǒng)方法凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色純化的mRNA相比，根據(jù)提供的包括暴露于2M KCl的方法純化的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)mRNA的體外轉(zhuǎn)錄樣品中的示例性蛋白質(zhì)水平。
[0032]圖8顯示了如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所示，根據(jù)提供的包括暴露于2MKCl的方法純化的體外轉(zhuǎn)錄樣品中的示例性CFTR mRNA水平。
[0033]圖9顯示了如瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色所示，與根據(jù)傳統(tǒng)方法純化的mRNA相比，根據(jù)提供的包括暴露于2M KCl的方法純化的體外轉(zhuǎn)錄樣品中的示例性CFTR mRNA水平。
[0034]定義
[0035]為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義某些術(shù)語如下。對(duì)以下術(shù)語及其它術(shù)語的其它定義在整個(gè)說明書中進(jìn)行闡述。
[0036]動(dòng)物:如本文所用的，術(shù)語“動(dòng)物”是指動(dòng)物界的任何成員。在一些實(shí)施方案中，“動(dòng)物”是指處于任何發(fā)育階段的人類。在一些實(shí)施方案中，“動(dòng)物”是指處于任何發(fā)育階段的非人類動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，非人類動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和/或豬)。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物包括但不限于，哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚、昆蟲和/或蠕蟲。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因工程動(dòng)物和/或克隆。
[0037]大約或約:如本文所用的，術(shù)語“大約”或“約”在應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的值時(shí)是指與所指的值相似的值。在某些實(shí)施方案中，除非另有說明或者從上下文顯而易見有所不同(除了此類數(shù)值將超過可能值的100%的情況之外)，術(shù)語“大約”或“約”是指以任一方向在(大于或小于)所述參考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的范圍內(nèi)的值。
[0038]生物活性:如本文所用的，短語“生物活性”是指在生物體系中，特別是在生物體中具有活性的任何藥物的特征。例如，在向生物體施用時(shí)對(duì)該生物體具有生物學(xué)效應(yīng)的藥物被視為具有生物活性。
[0039]表達(dá):如本文所用的，核酸序列的“表達(dá)”是指將mRNA翻譯成多肽(例如，抗體的重鏈或輕鏈)、將多個(gè)多肽(例如，抗體的重鏈或輕鏈)組裝成完整蛋白(例如，抗體)和/或?qū)⒍嚯幕蛲耆M裝的蛋白(例如，抗體)翻譯后修飾。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“表達(dá)”和“產(chǎn)生”以及語法等效項(xiàng)可互換使用。
[0040]功能性:如本文所用的，“功能性”生物分子是處于其呈現(xiàn)出它特征性的性質(zhì)和/或活性的形式的生物分子。
[0041]改進(jìn)、增高或降低:如本文所用的，術(shù)語“改進(jìn)”、“增高”或“降低”或者語法等效項(xiàng)表明相對(duì)于基線測(cè)量值如在開始本文所述的治療之前在相同個(gè)體中的測(cè)量值或者在沒有本文所述的治療下在對(duì)照受試者(或多個(gè)對(duì)照受試者)中的測(cè)量值的值。“對(duì)照受試者”是罹患與接受治療的受試者相同的疾病形式的受試者，其與該接受治療的受試者的年齡大約相同。
[0042]雜質(zhì):如本文所用的，術(shù)語“雜質(zhì)”是指限定量的液體、氣體或固體內(nèi)，不同于靶材料或化合物的化學(xué)組成的物質(zhì)。雜質(zhì)也稱為污染物。
[0043]體外:如本文所用的，術(shù)語“體外”是指發(fā)生在人工環(huán)境中，例如，在試管或反應(yīng)容器中，在細(xì)胞培養(yǎng)物等中而不是在多細(xì)胞生物體內(nèi)的事件。
[0044]體內(nèi):如本文所用的，術(shù)語“體內(nèi)”是指發(fā)生在多細(xì)胞生物體如人和非人類動(dòng)物內(nèi)的事件。在基于細(xì)胞的系統(tǒng)的上下文中，該術(shù)語可以用來指發(fā)生在活細(xì)胞(與例如體外系統(tǒng)相對(duì))內(nèi)的事件。
[0045]分離的:如本文所用的，術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)和/或?qū)嶓w，其已經(jīng)(I)與在最初產(chǎn)生(無論在自然界中和/或在試驗(yàn)環(huán)境中)時(shí)與它結(jié)合的組分中的至少一些分離，和/或
(2)通過人工進(jìn)行生產(chǎn)、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可以從與它們最初結(jié)合的其它組分的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者大于約99%分離。在一些實(shí)施方案中，分離的藥物是約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者大于約99%純度。在本文中使用時(shí)，若物質(zhì)基本上不含有其它組分，則它是“純的”。在本文中使用時(shí)，分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w的百分比純度的計(jì)算不應(yīng)該包括賦形劑(例如，緩沖劑、溶劑、水等)。
[0046]信使RNA(mRNA):如本文所