05]如上所述，用于TFF的過濾器可具有各種孔徑中的任一種，并且因此具有NMWL。在一些實(shí)施方案中，過濾器將具有介于10kDa和1，OOOkDa之間的NMWL。在一些實(shí)施方案中，過濾器將具有介于200kDa和700kDa之間的NMffL。在一些實(shí)施方案中，過濾器將具有介于200kDa和500kDa之間的NMWL。在一些實(shí)施方案中，過濾器將具有300kDa的NMWL。在一些實(shí)施方案中，過濾器將具有500kDa的NMWL。
[0106]在一些實(shí)施方案中，僅使用水溶劑進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明所述的切向流過濾。在一些實(shí)施方案中，使用水作為溶劑進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明所述的切向流過濾。
[0107]純化mRNA的表征
[0108]在各個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA基本上無來自于mRNA合成過程的雜質(zhì)，包括但不限于提前中斷的RNA序列、DNA模板和/或用于體外合成的酶試劑。
[0109]本發(fā)明提供的獨(dú)特優(yōu)勢是能夠去除或消除高度的提前中斷RNA序列(也稱為“短聚物”)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法去除多于約90%、95%、96%、97%、98%,99%或基本上所有的提前中斷RNA序列。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA基本上無提前中斷的RNA序列。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有少于約5% (例如，少于約4%、3%、2%或1% )的提前中斷RNA序列。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有少于約1% (例如，少于約0.9%,0.8%,0.7%,0.6%,0.5%,0.4%,0.3%、0.2%或0.1% )的提前中斷RNA序列。在一些實(shí)施方案中，如通過(例如)溴化乙錠和/或考馬斯亮藍(lán)染色測定，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有不可檢測的提前中斷RNA序列。在一些實(shí)施方案中，提前中斷的RNA序列包含少于15個堿基(例如，少于14、13、12、11、10、9或8個堿基)。在一些實(shí)施方案中，提前中斷的RNA序列包含約8_12個堿基。
[0110]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法去除或消除高度的用于體外合成的酶試劑，包括但不限于T7RNA聚合酶、DNA酶1、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明對去除T7RNA聚合酶特別有效。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法去除多于約90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或基本上所有用于體外合成的酶試劑(包括)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA基本上無用于體外合成的酶試劑(包括)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有少于約5 % (例如，少于約4%、3 %、2 %或I % )的用于體外合成的酶試劑(包括)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有少于約 1% (例如，少于約 0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或 0.1% )的用于體外合成的酶試劑(包括)。在一些實(shí)施方案中，如通過(例如)溴化乙錠和/或考馬斯亮藍(lán)染色測定，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA含有不可檢測的用于體外合成的酶試劑(包括)。
[0111]在各個實(shí)施方案中，根據(jù)本文所述的方法純化的mRNA保持高度完整性。如本文所用的，術(shù)語“mRNA完整性”通常是指純化后mRNA的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，mRNA完整性是指在切向流過濾后未降解的mRNA的百分比?？墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，例如通過RNA瓊脂糖凝膠電泳(例如，Ausubel 等，John ffeley&Sons, Inc., 1997, Current Protocols inMolecular B1logy)測定mRNA完整性。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA具有高于約95% (例如，高于約96%、97%、98%、99%或更高)的完整性。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA具有高于98%的完整性。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA具有高于99%的完整性。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明純化的mRNA具有高于大約100%的完整性。
實(shí)施例
[0112]實(shí)施例1.信伸RNA (mRNA)的牛成和純化
[0113]mRNA 的合成
[0114]在以下每個實(shí)施例中，在完全無RNA酶的條件下進(jìn)行mRNA的合成。除非另外明確表明，要求所有管、小瓶、移液管槍頭、移液管、緩沖液等均無核酸酶。
[0115]在下列實(shí)施例中，除非另有描述，由線性化DNA模板經(jīng)由體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。為生成所需mRNA前體(IVT)構(gòu)建體，用無RNA酶的水制備?10ug線性化DNA、rNTP(3.33mM)、DTT(1mM)、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、焦磷酸酶和反應(yīng)緩沖液(10x，800mM !fepes(pH8.0)、20mM 亞精胺、250mM MgCl2, pH 7.7)的混合物至 2.24mL 的最終體積。在37°C下孵育反應(yīng)混合物介于20分鐘-120分鐘之間范圍的時間。完成后，用DNA酶I再處理混合物15分鐘并相應(yīng)地猝滅。
[0116]5’帽和3’尾的添加
[0117]使來自前述IVT步驟(也可能來自初始TFF過濾)的純化mRNA產(chǎn)物在65°C下變性10分鐘。單獨(dú)地，將成份的GTP(20mM)、S_腺苷甲硫氨酸、RNA酶抑制劑、2’_0_甲基轉(zhuǎn)移酶和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶與反應(yīng)緩沖液(10x，500mM Tris-HCl (pH8.0)、60mM KC1、12.5mM MgCl2)混合在一起至8.3mL的終濃度。變性后，在冰上冷卻mRNA，然后添加到反應(yīng)混合物中。在37°C下孵育合并的溶液20-90分鐘范圍的時間。完成后，添加等分試樣的ATP(20mM)、聚腺苷酸聚合酶和加尾反應(yīng)緩沖液(10x，500mM Tris-HCl (pH8.0)、2.5M NaCUlOOmM MgCl2)并進(jìn)一步在37°C下孵育總反應(yīng)混合物20-45分鐘范圍的時間。完成后，猝滅最終反應(yīng)混合物并相應(yīng)地純化。
[0118]經(jīng)由切向流過濾純化
[0119]在以下實(shí)施例中，除非另有描述，切向流過濾(TFF)系統(tǒng)由濾膜和蠕動栗(Millipore Labscale TFF系統(tǒng))組成，液體以?130mL/分鐘的進(jìn)料速率穿過膜切向循環(huán)，滲透物的流速為30mL/流速。采用的TFF膜為MidiKros 500kDa mPES 115cm2 (SpectrumLabs)。使用之前，用無核酸酶的水洗滌濾筒并用0.2N NaOH進(jìn)一步清洗。最后用無核酸酶的水清洗系統(tǒng)直至滲透物和滲余物的pH達(dá)到pH?6。
[0120]實(shí)施例2.純化mRNA的分析[0121 ] 測試純化mRNA中酶的存在
[0122]除非另有描述，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色蛋白質(zhì)凝膠以確定在純化之前和之后存在的任何殘留試劑酶的存在。在一些情況下，也進(jìn)行BCA測定。
[0123]經(jīng)由瓊脂糖凝膠電泳測定評估m(xù)RNA完整性
[0124]除非另有描述，經(jīng)由凝膠電泳評估信使RNA大小和完整性。采用自流式1.0%瓊脂糖凝膠或Invitrogen E-Gel預(yù)制1.2%瓊脂糖凝膠。信使RNA按每孔1.0-1.5ug量上樣。完成后，使用溴化乙錠使信使RNA條帶可見。
[0125]體外mRNA完整性測定
[0126]除非另有描述，使用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行螢火蟲熒光素酶mRNA的體外轉(zhuǎn)染。在單獨(dú)的孔內(nèi)使用Iipofectamine進(jìn)行I微克各mRNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染。在所選時間點(diǎn)(例如4小時、8小時等)收獲細(xì)胞并分析各自的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。對于FFL mRNA而言，經(jīng)由生物發(fā)光測定分析細(xì)胞裂解產(chǎn)物的熒光素酶產(chǎn)量。
[0127]生物發(fā)光分析
[0128]在包括對提供的RNA的熒光評估的實(shí)施例中，除非另有說明，使用Promega熒光素酶測定系統(tǒng)(Item#E1500)進(jìn)行生物發(fā)光測定。通過向熒光素酶測定底物中添加1mL的熒光素酶測定緩沖液并經(jīng)由渦旋混合制備熒光素酶測定試劑。向96孔板上裝載大約20uL的勻漿樣品，接著向每份樣品裝載20uL板對照。單獨(dú)地，向96孔平底板的每個孔添加120uL焚光素酶測定試劑(如上所述制備)。然后使用Molecular Device Flex Stat1n儀器將每張板插入適當(dāng)腔室內(nèi)并測量發(fā)光(按相對光度單位(RLU)測量)。
[0129]實(shí)施例3.螢火蟲熒光素酶(FFL)信使RNA (mRNA)的生成和純化
[0130]該實(shí)施例說明，根據(jù)各個實(shí)施方案，切向流過濾(TFF)和變性劑的組合可根據(jù)提供的方法使用以產(chǎn)生高度純化的mRNA產(chǎn)物。在該實(shí)施例中，脲用作蛋白質(zhì)變性劑。
[0131]在該實(shí)施例中，經(jīng)由上述體外法轉(zhuǎn)錄一批5毫克的螢火蟲熒光素酶(FFL)RNA(SEQID N0:1，如下)以生成無帽和聚腺苷酸尾的前述中間構(gòu)建體。該反應(yīng)保持2.24mL的總體積并且在完成后用等體積的1M脲猝滅，使最終脲濃度達(dá)到5M。在室溫下孵育所得溶液5分鐘并轉(zhuǎn)移到切向流過濾(TFF)系統(tǒng)貯器內(nèi)。用無核酸酶的水將樣品稀釋至200mL并用1200mL無核酸酶的水，通過每次200mL超濾而洗滌。在此之后，用200mL 1mM檸檬酸鈉(pH6.4)處理樣品，接著用600ml無核酸酶的水洗滌。最后將樣品濃縮至?2mL并且在260nm( λ max)下經(jīng)由吸收作用測定終濃度。
[0132]密碼子優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶(FFL)mRNA(SEQ ID NO:1)
[0133]X2AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACC⑶C⑶AUUC⑶GAGCAAGAAAGGG⑶GCAAAAGAUC⑶CAAC⑶GCAAAAGAAG⑶ACCGAUCAUACA^^CAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUC(:UCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUC⑶GGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAG⑶AGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCC ⑶⑶ AY2
[0134]5’ 和 3’UTR 序列
[0135]X2 =
[0136]GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:2)
[0137]Y2 =
[0138]UUUGAAUU(SEQ ID NO:3)
[0139]如上所述，在9mL的最終反應(yīng)體積中大約5mg經(jīng)TFF純化的螢火蟲熒光素酶RNA加帽并加尾。在室溫下(RT)用5M脲處理一份該反應(yīng)混合物(6.7ml) 5分鐘并使用TFF純化。僅使用水經(jīng)由TFF純化大約1.5mg的帽/尾反應(yīng)混