)還原劑和/或7)經(jīng)由高鹽濃度的高離子強度。在一些實施方案中，特定試劑可屬于這些類別中的一種以上。
[0075]在一些實施方案中，一種或多種酶可用作變性劑以降解蛋白質(zhì)和用于mRNA合成的DNA模板。在一些實施方案中，適合的酶包括但不限于絲氨酸蛋白酶例如胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶和彈性蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶及其組合、脫氧核糖核酸酶(DNA酶)(例如脫氧核糖核酸酶1、II和/或IV)、限制酶(例如EcoR1、EcoRI1、BamH1、HindII1、Spel、Sph1、Stu1、XbaI)及其組合。
[0076]在一些實施方案中，酸可用作變性劑。在一些實施方案中，適合的酸為乙酸、甲酸、草酸、檸檬酸、苯甲酸、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、抗壞血酸、磺基水楊酸及其組合。
[0077]在一些實施方案中，溶劑可用作變性劑。在一些實施方案中，溶劑可為異丙醇、丙酮、甲乙酮、甲基異丁酮、乙醇、甲醇、地那錢(denatonium)及其組合。
[0078]在一些實施方案中，離液劑可用作變性劑。離液劑是通過干擾非共價力例如氫鍵和范德華力(van der ffaals force)破壞大分子例如蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構的物質(zhì)。在一些實施方案中，離液劑可為脲、硫脲、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、乙酸鋰、氯化鎂、十二烷基硫酸鈉、高氯酸鋰及其組合。
[0079]在一些實施方案中，用脲處理含有待純化的mRNA的摻雜制劑。在一些實施方案中，添加一定量的脲以致所得脲濃度為約IM或更高。在一些實施方案中，添加脲以致所得脲濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高、7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。在一些實施方案中，用硫氰酸胍處理含有待純化的mRNA的摻雜制劑。在一些實施方案中，添加一定量的硫氰酸胍以致所得硫氰酸胍濃度為約IM或更高。在一些實施方案中，添加硫氰酸胍以致所得硫氰酸胍濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高、7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。
[0080]在一些實施方案中，還原劑可用作變性劑。還原劑是為另一物質(zhì)給出電子，從而自身變氧化的化合物。在一些實施方案中，還原劑可為氫化鋁鋰、鈉汞齊、二硼烷、硼氫化鈉、亞硫酸鹽、二異丁基氫化鋁、亞磷酸鹽、一氧化碳、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦及其組合。
[0081]在一些實施方案中，pH、熱量和/或重金屬(例如鉛、汞或鎘)中的一種或多種可用作變性劑。已知極端PH引起蛋白質(zhì)變性。雖然蛋白質(zhì)鏈的骨架為中性，但是構成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基常常含有酸性和堿性基團。這些基團通常帶電并且可與相反電荷的基團形成鹽橋。因此，極端PH可改變在這些酸性和堿性基團上的電荷，破壞鹽橋。
[0082]在一些實施方案中，pH較溫和的變化也可影響蛋白質(zhì)的活性和溶解性。與個別氨基酸一樣，蛋白質(zhì)具有負電荷的數(shù)量等于正電荷的數(shù)量時的等電點。這通常是水溶性最低的點。在等電PH下，在分子上不存在凈電荷。單分子具有相互靠近、凝結(jié)和從溶液中沉淀出來的傾向。在高于或低于等電PH的pH下，分子分別具有凈負電荷或正電荷。因此當?shù)鞍踪|(zhì)分子相互靠近時，其具有相同的總電荷并且相互排斥。
[0083]在一些實施方案中，熱量可用作變性劑。熱量可為蛋白質(zhì)分子供給動能，使其原子更迅速地振動。在一些實施方案中，這將破壞相對較弱的力例如氫鍵和疏水性相互作用。熱量也可用于滅菌以使細菌中的酶變性并因此破壞細菌中的酶。
[0084]在一些實施方案中，金屬離子例如汞(II)、鉛(II)和銀的鹽由于其與二硫基和酸性氨基酸的羧酸鹽離子形成強健的能力，可用作變性劑。因此，其破壞二硫橋和鹽鍵并且使蛋白質(zhì)從溶液中作為不溶性金屬-蛋白質(zhì)鹽沉淀出來。
[0085]在一些實施方案中，高濃度的鹽(高鹽度)也可用作變性劑。已知高濃度的鹽使蛋白質(zhì)和核酸從水溶液中沉淀。在一些實施方案中，鹽的高濃度可介于IM和1M之間，包括IM和10M。在一些實施方案中，鹽的高濃度可介于2M和9M之間，包括2M和9M。在一些實施方案中，鹽的高濃度可介于2M和8M之間，包括2M和8M。在一些實施方案中，鹽的高濃度可介于2M和5M之間，包括2M和5M。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于IM濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于2M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于3M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于4M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于5M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于6M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于7M濃度。在一些實施方案中，鹽的高濃度可高于8M濃度。在一些實施方案中，單種鹽用作變性劑。在一些實施方案中，多于一種鹽用作變性劑。
[0086]在一些實施方案中，用作變性劑的鹽可為鈣鹽、鐵鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽或其組合。在一些實施方案中適合用作變性劑的示例性特定鹽類包括但不限于氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)、氯化鋰(LiCl)、氯化鈣(CaCl2)、溴化鉀(KBr)、溴化鈉(NaBr)、溴化鋰(LiBr)。在一些實施方案中，摻雜制劑經(jīng)受的變性劑為氯化鉀(KCl)。在一些實施方案中，添加KCl以致所得KCl濃度為約IM或更高。在一些實施方案中，添加KCl以致所得KCl濃度為約2M或更高、3M或更高、4M或更高，或5M或更高。
[0087]在一些實施方案中，可能可取的是用一種或多種變性劑孵育摻雜制劑一段時間。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑少于I分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑I分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑2分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑3分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑4分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑5分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑10分鐘。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑I小時。在一些實施方案中，用變性劑孵育摻雜制劑2小時。
[0088]在一些實施方案中，在室溫(例如，約20-25°C )下用一種或多種變性劑孵育摻雜制劑。在一些實施方案中，在低于室溫的溫度下用一種或多種變性劑孵育摻雜制劑。在一些實施方案中，在高于室溫的溫度下用一種或多種變性劑孵育摻雜制劑。
[0089]純化
[0090]在幾個實施方案中，在暴露于變性條件之前和/或之后，用切向流過濾從摻雜制劑純化mRNA。在一些實施方案中，切向流過濾在向體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之前進行。在一些實施方案中，切向流過濾在向體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之后進行。在一些實施方案中，切向流過濾在向體外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之前和之后進行。
[0091]傳統(tǒng)膜過濾
[0092]通常，膜過濾涉及使用一張或多張插入的滲透膜從流體中分離出固體。膜過濾也可用于從氣態(tài)樣品中過濾顆粒。存在兩種主要的膜過濾形式，僅僅由于溶解-擴散進行的被動過濾，和使用正壓或負壓(即真空)迫使液體或氣體穿過所述膜的主動過濾。
[0093]傳統(tǒng)膜過濾也稱為“死端”過濾。以這種形式，將進料載至膜上并通過正壓或負壓推動。死端過濾往往便宜而簡單，主要缺點是膜受非滲透性或緩慢滲透性溶質(zhì)(也稱為滲余物)污損或堵塞，和濃度極化。通常，膜往往在推動力增加時更迅速地堵塞或污損。當膜污損或堵塞時，過濾速率降低并且最終沒有滲透物能夠通過直至更換或清潔過濾器。濃度極化是其中非滲透性溶質(zhì)在過濾器表面聚集并且最終形成進一步阻止?jié)B透性溶質(zhì)穿過所述膜的一類次生膜的現(xiàn)象。因此，死端過濾通常用于批式工藝中。
[0094]切向流過濾
[0095]切向流過濾(TFF)，也稱為錯流過濾，是其中待過濾材料切向穿過過濾器，而不是通過過濾器的一類過濾。在TFF中，不需要的滲透物通過過濾器，而所需滲余物經(jīng)過過濾器并且在下游聚集。重要的是注意在TFF中滲余物中通常含有所需材料，這與通常在傳統(tǒng)死端過濾中遇到的相反。
[0096]根據(jù)待過濾的材料，TFF通常用于微濾或超濾。通常將微濾定義為過濾器的孔徑介于0.05 μ m和1.0 μ m之間，包括0.05 μ m和1.0 μ m的情況，而超濾通常涉及孔徑小于0.05μπι的過濾器?？讖竭€決定了特定過濾器的標稱分子量極限(NMffL)，也稱為截留分子量(MffCO)，微濾膜通常具有大于1，000千道爾頓(kDa)的NMffL并且超濾過濾器具有介于IkDa 和 1，OOOkDa 之間的 NMWL。
[0097]切向流過濾的主要優(yōu)點是改為沿著過濾器的表面運送在傳統(tǒng)“死端”過濾期間可在過濾器內(nèi)聚集并阻塞過濾器的非滲透性顆粒(有時稱為“濾餅”)。這種優(yōu)點允許切向流過濾廣泛用于需要連續(xù)操作的工業(yè)過程中，因為通常不需要取下并清潔過濾器而明顯減少了停機時間。
[0098]切向流過濾可用于幾個目的，尤其包括濃縮和滲濾。濃縮是由此從溶液中去除溶劑，而保留溶質(zhì)分子的過程。為了有效地濃縮樣品，使用具有大大低于待保留的溶質(zhì)分子的分子量的NMWL或MffCO的膜。通常，技術人員可以選擇具有低于靶分子的分子量3至6倍的NMWL或MffCO的過濾器。
[0099]滲濾是不需要的小顆粒由此通過過濾器，而在滲余物中保持需要的較大分子，不改變?nèi)芤褐心切┓肿拥臐舛鹊姆逐s過程。滲濾常常用于從溶液中去除鹽或反應緩沖液。滲濾可以是連續(xù)或不連續(xù)的。在連續(xù)滲濾中，以濾液產(chǎn)生的相同速率向樣品進料中添加滲濾溶液。在不連續(xù)滲濾中，首先稀釋溶液，然后濃縮回到起始濃度。可重復不連續(xù)滲濾，直至達到所需的溶質(zhì)分子濃度。
[0100]在典型TFF過程中重要的至少三個過程變量:跨膜壓差、進料速率和滲透物的流速。跨膜壓差是推動流體，帶著滲透性分子一起通過過濾器的力。在一些實施方案中，跨膜壓差介于I和30鎊/平方英寸(PSi)之間，包括I和30鎊/平方英寸。
[0101]進料速率(也稱為錯流速度)是溶液流過進料通道并穿過過濾器的速率。進料速率決定了清除可能以其它方式填塞或污損過濾器并從而限制濾液流速的分子的力。在一些實施方案中，進料速率介于50和500mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于50和400mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于50和300mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于50和200mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于75和200mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于100和200mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率介于125和175mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率為130mL/分鐘。在一些實施方案中，進料速率介于60mL/分鐘和220mL/分鐘之間。在一些實施方案中，進料速率為60mL/分鐘或更高。在一些實施方案中，進料速率為10mL/分鐘或更高。在一些實施方案中，進料速率為150mL/分鐘或更高。在一些實施方案中，進料速率為200mL/分鐘或更高。在一些實施方案中，進料速率為220mL/分鐘或更高。
[0102]滲透物的流速是從體系中去除滲透物的速率。對于恒定進料速率而言，增加滲透物流速可增加穿過過濾器的壓力，導致過濾速率提高，同時還可能增加過濾器堵塞或污損的風險。Michaels 等，"Tangential Flow Filtrat1n^in Separat1nsTechnology, Pharmaceutical and B1technology Applicat1ns(ff.P.0lson 編，Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, 111.1995)中描述了用于 TFF 的原理、理論和裝置。對代表對TFF的改進的高性能切向流過濾(HP-TFF)的描述，還見美國專利第5，256，294和5，490，937號。在一些實施方案中，流速介于10和10mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和90mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和80mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和70mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和60mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和50mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于10和40mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速介于20和40mL/分鐘之間。在一些實施方案中，流速為30mL/分鐘。
[0103]可使用本文所述的各種工藝變量的任何組合。在一些實施方案中，以大約100-200mL/ 分鐘(例如，大約 100_180mL/ 分鐘、100_160mL/ 分鐘、100_140mL/ 分鐘、110-190mL/分鐘、110_170mL/分鐘或110_150mL/分鐘)的進料速率和/或大約10_50mL/分鐘(例如，大約10-40mL/分鐘、10-30mL/分鐘、20_50mL/分鐘或20_40mL/分鐘)的流速進行切向流過濾。在一些實施方案中，以大約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mL/分鐘的進料速率和/或大約10、20、30、40或50mL/分鐘的流速進行切向流過濾。
[0104]進一步地適應大(商業(yè))規(guī)模純化的流速將需要以大約10L-200L/分鐘(例如，大約 10-180L/ 分鐘、100-160L/ 分鐘、100-140L/ 分鐘、110-190L/ 分鐘、110-170L/ 分鐘或110-150L/分鐘)的進料速率和/或大約10-50L/分鐘(例如，大約10-40L/分鐘、10-30L/分鐘、20-50L/分鐘或20-40L/分鐘)的流速進行切向流過濾。在一些實施方案中，以大約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200L/ 分鐘的進料速率和 / 或大約 10、20、30、40或50L/分鐘的流速進行切向流過濾。
[01