與玉米熱帶銹病(玉米殼銹菌)抗性相關(guān)聯(lián)的基因座的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】與玉米熱帶銹病（玉米殼銹菌）抗性相關(guān)聯(lián)的基因座
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年11月3日的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201080060463. 7"與玉米熱 帶銹?。ㄓ衩讱やP菌）抗性相關(guān)聯(lián)的基因座"的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0003] 本專(zhuān)利申請(qǐng)要求提交于2009年11月4日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/257, 977的優(yōu)先權(quán)， 該臨時(shí)申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開(kāi)涉及用于提高植株對(duì)熱帶銹病抗性的組合物和方法和用于鑒定與受關(guān)注 的性狀相關(guān)聯(lián)的等位基因變異的方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 熱帶銹病是由病原體玉米殼銹菌（Physopella zeae (Mains) Cummins&Ramachar) (與Angiopsora zeae Mains同義）引起的真菌病害，其以前歸類(lèi)為Angiopsora zeae Mains (Donald G. White，編輯，1999. Compendium of corn diseases.第三版.APS Press， ISBN 0-89054-234-1)。熱帶銹病能夠快速發(fā)展，在短時(shí)間內(nèi)殺死植株。
[0006] 病害管理策略包括作物輪作、通過(guò)耕作破壞以前的玉米殘留、以及施用殺真菌劑， 全部這些方法旨在減少真菌種菌。然而，控制熱帶銹病的最有效并且最優(yōu)選的方法是種植 抗病雜交種。
[0007] 通過(guò)減少真菌種菌控制熱帶銹病的方法需要農(nóng)民方面附加的時(shí)間和資源，并且此 外可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生破壞效應(yīng)。這使得種植抗病雜交種對(duì)農(nóng)民和一般公眾來(lái)說(shuō)甚至更有吸引 力。因此，希望提供鑒定并選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 提供了鑒定并選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的玉米植株的組合物和方法。還提供 了標(biāo)記輔助選擇具有對(duì)熱帶銹病提高抗性的植株的方法。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質(zhì)的方 法，所述方法檢測(cè)與PHMTR(SEQ ID N0 :155)位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID N0 : 167位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)的第一標(biāo)記基因座的至少一種等位基因的 存在，并且選擇包含連鎖并關(guān)聯(lián)PHMTR(SEQ ID N0:155)的位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列 SEQ ID N0 :167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型的第一標(biāo)記基因座的至少一種等位基因 的玉米植株或種質(zhì)。在單一減數(shù)分裂圖譜上，所述第一標(biāo)記基因座的至少一個(gè)等位基因可 與PHMTR(SEQ ID N0 :155)位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID N0 :167位點(diǎn)337-339 處的"GAG"單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)至多20cM。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株或種質(zhì)的 方法，所述方法檢測(cè)PHMTR(SEQ ID N0:155)的位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID NO :167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型；并且選擇包含PHMTR(SEQ ID NO :155)的位點(diǎn) 16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID NO : 167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型的玉米植 株或種質(zhì)。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法使用標(biāo)記基因座序列、一部分標(biāo)記基因座序列、或標(biāo)記基因座序列的互補(bǔ)序列、或 它們的一部分作為標(biāo)記探針檢測(cè)玉米植株基因組中的標(biāo)記基因座。所述標(biāo)記探針在嚴(yán)格 條件下雜交到介于下述序列之間并包括它們的連續(xù)DNA上：SEQ ID N0 :89或基于Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO :89具有95%的同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :96或基于 Clustal V比對(duì)方法與SEQ ID NO :96具有95%的同一性的核苷酸序列，并且所述標(biāo)記基因 座包含與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法檢測(cè)與所述玉米植株的種質(zhì)中提高的抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)標(biāo)記等位基因。標(biāo) 記基因座可選自任一個(gè)以下標(biāo)記基因座：PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、 C00436-801-U、 PHM187-7-U、 C00423-801-U、 PHM5028-24-U、 PHM13818-15-U、 PHM1572卜39-U、 PHM15721-180-U、 C00441-801-U、 C00441-802-U、 PHM4370-19-U、 PHM731-107-U、 C0007卜01-U、 PHM8249-21-U、 C00428-801-U、 PHM18427-13-U、 PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U 和 PHM4003-13-U ;PHM 標(biāo)記 PHM15590、PHM13818、 PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731 和 PHM15721 ;Sub2e、Sub9d、Subl9c、Sub23m、 C06621-1-K2和C06621-1-K4 ;以及與這些標(biāo)記連鎖的任何其它標(biāo)記。標(biāo)記基因座也存在于 染色體10上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含并側(cè)接：
[0013] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0014] ii PHM15590 和 PHM15721 ;
[0015] iii. C00441 和 C00428 ;
[0016] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0017] V. C00071 和 PHM731。
[0018] 標(biāo)記基因座包含與增強(qiáng)的熱帶銹病抗性相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)等位基因。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法， 所述方法檢測(cè)與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)的玉米植株種質(zhì)中的單倍型。所述單倍型在 一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座上包含等位基因，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座存在于染色體10 上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含并側(cè)接：
[0020] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0021] ii PHM15590 和 PHM15721 ;
[0022] i i i ? C00441 和 C00428 ;
[0023] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0024] v. C00071 和 PHM731。
[0025] 所述單倍型可包含PHMTR的位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID N0 :167的 位點(diǎn) 337-339 處的 "GAG"。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。 在該方法中，獲取第一玉米植株，其中所述玉米植株具有標(biāo)記基因座的至少一個(gè)等位基 因，所述標(biāo)記基因座位于染色體10上的任何以下區(qū)間內(nèi)，其包含并側(cè)接：
[0027] i. PHM15590 和 PHM9535 ;
[0028] ii. PHM15590 和 PHM15721 ;
[0029] i i i ? C00441 和 C00428 ;
[0030] iv. PHM731 和 PHM15721 ;和
[0031] v. C00071 和 PHM731 ;
[0032] 并且所述等位基因與對(duì)熱帶銹病的提高抗性相關(guān)聯(lián)。所述第一玉米植株與第二玉 米植株雜交，并且對(duì)所得子代植株進(jìn)行第一玉米植株的等位基因的評(píng)價(jià)。然后選擇具有所 述第一玉米植株的等位基因的子代植株作為對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的植株。
[0033] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的玉米植株的方法。 在該方法中，獲取第一玉米植株，其中所述玉米植株在其基因組中包含PHMTR的位點(diǎn)16處 的"T"缺失或參考序列SEQ ID N0 :167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型。所述第一玉米 植株與第二玉米植株雜交，并且對(duì)所得子代植株進(jìn)行PHMTR的位點(diǎn)16處的"T"缺失或參考 序列SEQ ID N0 :167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型的評(píng)價(jià)。然后選擇具有PHMTR的位 點(diǎn)16處的"T"缺失或參考序列SEQ ID N0 :167的位點(diǎn)337-339處的"GAG"單倍型的子代 植株作為對(duì)熱帶銹病具有提高抗性的植株。
[0034] 此外，通過(guò)上述方法鑒定或選擇的玉米植株是受關(guān)注的，其中所述植株不是 CML339。此外，由上述方法鑒定或選擇的玉米植株的子代是受關(guān)注的。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定與期望的性狀形式相關(guān)聯(lián)的等位基因變異的方 法。在這些方法中，比對(duì)開(kāi)放：延伸代價(jià)比大于10的原始序列并通過(guò)修剪尾部除去背景噪 音。然后修剪隨機(jī)的等位基因變異，并使用非加權(quán)配對(duì)組算數(shù)平均法（UPGMA)。重復(fù)進(jìn)行隨 機(jī)等位基因變異的修剪和應(yīng)用UPGMA于比對(duì)直至鑒定出表型關(guān)系圖。然后可從表型關(guān)系圖 中鑒定與受關(guān)注的表型相關(guān)聯(lián)的等位基因變異。
[0036] 附圖和序列表說(shuō)明
[0037] 根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描 述和附圖以及序列表構(gòu)成本專(zhuān)利申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以 三字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219(No.2) :345-373(1984)所描述的 IUPAC-IUBMB 標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，2): 345-373(1984)，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào) 和格式符合如37 C.F.R. § 1.822所示的規(guī)則。
[0038] 圖1示出定位BAC的物理圖譜排列（獲取自Maize Genome Browser，它在因特網(wǎng) 上公開(kāi)可用），它裝配到染色體10區(qū)域上，該區(qū)域由C0497L12和b0191E02定位并包括它 們。示出了本文所述的PHM標(biāo)記位點(diǎn)（由PHM15590和PHM15721定位并包括它們的區(qū)域）， 它們是位于所述區(qū)間內(nèi)的公開(kāi)標(biāo)記位點(diǎn)。
[0039] 圖2A和2B分別示出了熱帶和南方銹病評(píng)分的PH468 x PHS6Y F2種群的頻率分 布。
[0040] 圖3示出了使用PH468 x PHS6Y F2種群獲得的混合區(qū)間作圖結(jié)果。在染色體10 的短臂上鑒定顯著性峰。在x軸上的標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于PHB基因圖譜。y軸代表L0D評(píng)分。
[0041] 圖4 (a)易感自交系和使用PHS6Y作為供體親本的對(duì)應(yīng)抗性轉(zhuǎn)化。（b)用易感型自 交系制得的雜交體。（c)用相同自交系的抗性（"轉(zhuǎn)化的"）型制得的雜交體。這顯示熱帶 銹病基因在雜交水平上具有顯性效應(yīng)。
[0042] 圖5示出對(duì)熱帶銹?。ㄗ髠?cè)）高度易感的雜交體和已經(jīng)從PHS6Y轉(zhuǎn)化成具有提高 抗性的相同雜交體（右側(cè)）。
[0043] 圖6示出用作引物設(shè)計(jì)參考的公開(kāi)BAC克隆，其用于對(duì)熱帶銹病抗性的和易感的 基因型玉米品系。關(guān)于BAC重疊的內(nèi)部信息用于進(jìn)一步將2-2. 5Mb區(qū)域的序列順序縮小至 24個(gè)子區(qū)域。
[0044] 圖7示出通過(guò)對(duì)熱帶銹病抗性的和易感的玉米品系的基因分型獲得的部分參考 序列（頂部），所述基因分型使用設(shè)計(jì)用于克隆ID Ct9050c064Gllc的PCR引物（SEQ ID N0:133和134)(表9)。SEQ ID N0:137-142示出獲取自抗性品系的擴(kuò)增子，而SEQ ID NO :143-154示出獲取自易感品系的擴(kuò)增子。用灰色突出顯示的區(qū)域示出參考序列（稱(chēng)為 PHMTR;SEQ ID N0:155)的21bp區(qū)域。在bpl6具有T-缺失的玉米品系（用箭頭示出）都 顯示對(duì)熱帶銹病的提高抗性并具有序列SEQ ID N0 :156。
[0045] 圖8示出使用引物SEQ ID NO :135和SEQ ID NO :136獲得的擴(kuò)增子序列的部分比 對(duì)。發(fā)現(xiàn)"GAG"單倍型（框內(nèi)）是全部具有提高熱帶銹病抗性的品系獨(dú)有的。
[0046] 本文所附的序列描述和序列表遵循在37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的用于 專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)中的核苷酸和/或氨基酸序列的規(guī)定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)的 核苷酸序列的單字母編碼和氨基酸序列的三字母編碼，IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)描述于Nucleic Acids Res. 13:3021-3030(1985)和 Biochemical J. 219(2) :345-373(1984)，所述文獻(xiàn) 以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合如37 C.F.R. § 1. 822所示的規(guī)則。
[0047] 表1列出了本文所述與InvaderPlus產(chǎn)品標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的序列以及在所附序列表中 的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符（SEQ ID N0 :)。
[0048] 表 1: InvaderPlus產(chǎn)品標(biāo)記
[0049]
[0050] 表2列出了本文所述與PHM標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的序列以及在所附序列表中的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符 (SEQ ID N0 :) 〇
[0051] 表2: PHM標(biāo)iP,序列：擴(kuò)增子和引物信息
[0052]
[0053] SEQ ID NO :129 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c497L12e 的 L 引物。
[0054] SEQ ID NO :130 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c497L12e 的 R 引物。
[0055] SEQ ID NO :131 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c064Glld 的 L 引物。
[0056] SEQ ID NO :132 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c064Glld 的 R 引物。
[0057] SEQ ID NO :133 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c064Gllc 的 L 引物。
[0058] SEQ ID NO :134 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050c064Gllc 的 R 引物。
[0059] SEQ ID NO :135 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050bl91E02m 的 L 引物。
[0060] SEQ ID NO :136 是被設(shè)計(jì)用于克隆 ID Ct9050bl91E02m 的 R 引物。
[0061] SEQ ID NO : 137 是使用 SEQ ID NO : 133 和 SEQ ID NO : 134 作為引物以及 PHS6Y DNA獲得的擴(kuò)增子序列。
[0062] SEQ ID NO : 138 是使用 SEQ ID NO : 133 和 SEQ ID NO : 134 作為引物以及 PHIJG22 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PHIJG22是抗熱帶銹病的玉米自交系。
[0063] SEQ ID NO :139 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作為引物以及 PH1FI71 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH1FT71是抗熱帶銹病的玉米自交系。
[0064] SEQ ID NO :140 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作為引物以及 PH1G3H1 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH1G3H1是抗熱帶銹病的玉米自交系。
[0065] SEQ ID N0 :141 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH1JG01 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH1JG01是抗熱帶銹病的玉米自交系。
[0066] SEQ ID N0 :142 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PHS7W DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PHS7W是抗熱帶銹病的玉米自交系。
[0067] SEQ ID N0 :143 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH7W3 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH7W3是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0068] SEQ ID NO :144 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作為引物以及 PH9VF DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH9VF是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0069] SEQ ID NO :145 是使用 SEQ ID NO :133 和 SEQ ID NO :135 作為引物以及 PHBNA DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PHBNA是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0070] SEQ ID N0 :146 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH2JR DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH2JR是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0071] SEQ ID N0 :147 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH0TJ DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH0TJ是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0072] SEQ ID N0 :148 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH467 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH467是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0073] SEQ ID N0 :149 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH48F DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH48F是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0074] SEQ ID N0 :150 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH7WC DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH7WC是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0075] SEQ ID N0 :151 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 62OTNA 獲得的擴(kuò)增子序列。625是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0076] SEQ ID N0 :152 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PHP3P1 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PHP3P1是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0077] SEQ ID N0 :153 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PHY7M2 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PHY7M2是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0078] SEQ ID N0 :154 是使用 SEQ ID N0 :133 和 SEQ ID N0 :135 作為引物以及 PH147G5 DNA獲得的擴(kuò)增子序列。PH147G5是易感熱帶銹病的玉米自交系。
[0079]